中华人民共和国农业行业标准

Azotobacter fertilizer

2000-12-22发布 2001-04-01实施

中华人民共和国农业部 发 布

前 言

本标准在原有标准 NY227-1994《微生物肥料》的基础上，对其中的固氮菌肥料部分进行修改。

主要修改内容如下：

—在技术要求中删除成品无害化指标；

—在检验方法中增加允许差，并增加抽样和判定规则。

本标准自实施之日起，同时代替 NY227-1994中的固氮菌肥料部分。

本标准的附录 A、附录B、附录C都是标准的附录。

本标准由中华人民共和国农业部提出。

本标准起草单位：农业部微生物肥料质量监督检验测试中心、中国农业科学院土壤肥料研究所。

本标准主要起草人：李元芳、吴观以、李慧荃、葛诚、沈德龙。

固氮菌肥料

Azotobacter fertilizer

1 范围

本标准规定了固氮菌肥料的分类、技术要求、检验方法、检验规则、标志、包装、运输、贮存等。

本标准适用于含有益的固氮菌、能在土壤和多种作物根际中固定空气中的氮气 ,供作物氮素营养,又能分泌激素剌激作物生长的活体制品。本标准也适用于以固氮菌为主的含有能促进固氮、生长的植物促生根际细菌(PGPR)的复合固氮菌肥料。

2 引用标准

下列标准所包含的条文，通过在本标准中引用而构成为本标准的条文。本标准出版时，所示版本均有效。所有标准都会被修订，使用本标准的各方应探讨使用下列标准最新版本的可能性。

GB/T 625一1989 化学试剂 硫酸

GB/T 629一1997 化学试剂 氢氧化钠

GB/T 1250一1989 极限数值的表示方法和判定方法

GB/T 6543一1986 瓦愣纸箱

GB/T 6682一1992 分析实验室用水规格和试验方法

3 定义

本标准采用下列定义：

3.1 自生固氮菌

在土壤里能固定空气中的氮，供作物氮素营养，又能分泌激素刺激作物生长的微生物。

3.2根际联合固氮菌

既依赖根际环境生长，又在根际中固定空气中的氮气，对作物的生长发育产生积极作用的微生物。

3.3 固氮效能

固氮菌每消耗 1g碳水化合物（糖）从空气中摄取氮素的毫克数，固氮 效能用mg氮/g糖表示。

4 产品分类

4.1 按形态不同，分为液体固氮菌肥料、固体固氮菌肥料和冻干固氮菌肥料。

4.2 按菌种及特性分为：自生固氮菌肥料、根际联合固氮菌肥料、复合固氮菌肥料。

5 技术要求

5.1 菌种

在含一种有机碳源的无氮培养基中能固定分子氮，并具有一定固氮效能。菌体一般为短杆状（固氮螺菌属菌体呈螺旋状），革兰氏染色阴性。

5.1.1 自生固氮菌

用固氮菌属（ Azotobacter）、氮单胞菌属（Azomonas）的菌种，也可用茎瘤根瘤菌（Azorhizobium）和固氮芽孢杆菌（Paenibacillus azotofixans）的菌株。

5.1.2 根际联合固氮菌

可用下列菌种：固氮螺菌（ Azospirillum）；阴沟肠杆菌（Enteroba）经鉴定为非致病菌的菌株；粪产碱菌（Alcaligenes faecalis）经鉴定为非致病菌的菌株；肺炎克氏杆菌（Klebseilla pneumoniae）经鉴定为非致病菌的菌株。

使用本准则规定之外的菌种生产固氮菌肥料时，菌种必须经过鉴定，并符合 5.1要求。

生产固氮微生物肥料所使用的菌种，必要时还要进行菌种染色鉴别（见附录 B）和菌种固氮效能测定（见附录C）。

5.2 成品技术指标(见表1)

表 1 成品技术指标

6 抽样

按每一发酵罐菌液制成的产品为一批，逐批抽样检验。抽样过程要严格避免杂菌污染。 6.1 抽样工具及用品

抽样前预先准备好无菌塑料袋 (或塑料瓶)、金属勺、剪刀、封口机(或封口胶带)、牛皮纸封样袋、标签、抽样封条和胶水。

6.2 抽样数量及抽样方法

在成品库抽样，按“ ”形分层设点抽样，抽样以件为单位，小包装产品以一包装箱为一件。大包装（30-50kg）产品以一袋（或一桶）为一件。抽样基数由样品基数的大小确定。1-10件，全部抽样。11-200件，抽样10件；201-400件，抽取20件。样品基数大于400件，按照超过部分的2%增加抽样件数。总件数不超过40件。

每件小包装产品抽取一小袋，在无菌条件下每袋取样 200g。将所有样品混匀，按四分法缩到2000g，分装4袋，然后封口。每2袋为一份装入牛皮纸封样袋。

液体产品每件吸取 10mL，一同防入无菌的三角瓶中，混匀后分成两份，每份250mL。冻干产品，每件取一支防入无菌的三角瓶中，加无菌液体培养液，溶解混匀后分成两份，每份50mL。贴上抽样标签和封条（一份被抽样单位留存，一份交检测中心检测）。

7 检验方法

7.1 仪器设备及试剂

7.1.1 仪器设备

生物显微镜（ 10×100）；

菌落计数器；

恒温培养箱；

恒温干燥箱；

恒温摇床；

灭菌锅；

无菌室或超净工作台；

酸度计；

试管：ф 15mm×150mm，ф18mm×180mm；

培养皿：直径 9cm；

三角瓶： 500mL；

无菌吸管： 1、2、5、10mL；

玻璃刮刀；

滤纸；

酒精灯；

标准筛：孔径 0.18mm和0.15mm；

1号羊毛画笔；

无菌水；

无离子水。

7.1.2 试剂

选择培养基（附录 A）；

刚果红染液（ 0.5%）。

7.2 成品检验

7.2.1 气味检验

取固氮菌肥料样品打开包装，进行感官检验。

7.2.2 外观检验

将固体固氮菌肥料包装打开，装在白色搪瓷盘中，将液体固氮菌肥料摇匀，在明亮光线下进行感官检验。

7.2.3 pH值测定

液体固氮菌肥料的 pH值测定：取供检菌液直接测定pH值，取三次测定结果的平均数。

固体固氮菌肥料的 pH值测定：取50mL烧杯一个，加入菌肥25g，无离子水25mL。通过磁力搅拌使溶液均匀后用酸度计测定pH值。取三次测定结果的平均数。

7.2.4 含水量测定

称取固体固氮菌肥料三份，每份 20.00g，精确到0.01g，放入已称恒重的铝盒中。置105℃干燥箱内烘烤4h，移至干燥器内，冷却后称重。根据烘干前后质量差按式(l)计算含水量。取三个样品测定数的平均值。平行样品绝对偏差应低于1%。

含水量 (%)=（m 0 -m 1 ）/m 0 ×100                       ………………(1)

式中： m 0 一烘干前样品质量，g

      m 1 一烘干后样品质量，g。

7.2.5 吸附剂颗粒细度测定

称样 10.00g(精确至0.01g)，置于标准筛中(直径分别为0.18mm和0.15mm)，用水冲洗，用毛笔轻刷，至粉末不再通过为止。将筛余物置105~110℃温度下烘干，称重。筛余物百分含量按式(2)计算：

筛余物 (%)=筛余物质量/（1-样品含水量百分数）/样品质量×100 ………(2)

7.2.6 有效活菌数及杂菌率的测定

采用平板计数法测定固氮菌活菌数及杂菌率。

采样应不少于 500g，从中抽取10.00g，加入带玻璃珠的100mL的无菌水中(液体菌剂取l0mL加入90mL的无菌水中)，静置20min后在旋转式摇床上200r/min充分振荡30min，即成母液的菌悬液。

用无菌吸管分别吸取 5mL上述母液的菌悬液加入45mL无菌水中，混匀成1：10稀释的菌悬液，这样依次稀释，分别得到1：1×10 2 ，1：1×10 3 ，1：1×10 4 ，1：1×10 5 等浓度（每个稀释度必须更换无菌吸管）。

用 0.5mL无菌吸管分别吸取不同稀释度菌悬液0.1mL，加至直径为9cm的选择培养基（见附录A）表面，用无菌玻璃刮刀将菌悬液均匀地涂于琼脂表面，或取1mL不同稀释度菌悬液加入培养皿内，与琼脂培养基混匀，每个样品取3个连续适宜稀释度，每一稀释度重复3次，同时加无菌水的空白对照。28℃培养2~3d后每个稀释度取5~10个菌落的菌体，涂片染色（见附录B）。显微镜观察识别后，选一个适宜稀释度（菌落在30~300个之间的平板），计算出同一稀释度三个平皿上菌落平均数。

杂菌数是指在选择培养基上，除有效活菌外的其他种菌的菌落数与马丁培养基上霉菌数之和。马丁培养基 10-4稀释度菌悬液加样，操作步骤同样品有效活菌数检测操作。

7.2.6.2 允许差

平行样品误差按式（ 3）计算，并应符合表2的规定。

……………… (3)

                表2 平板上菌落数对应的单一标准差

7.2.6.3 测定结果的计算

按式（ 4）、式（5）计算样品的有效活菌数及杂菌率

有效活菌数（个 /g）=菌落平均数×稀释倍数×母液菌悬液的体积/菌剂克数或毫升数/加样量 …………(4)

杂菌率 (%)=杂菌总数/（固氮菌数+杂菌总数）×100              …………………(5)

7.2.7有效期检验

在产品说明书标明的有效期到达前 10d测定成品各项指标，方法同7.2.1 ~ 7.2.6。

8 检验规则

8.1 检验分类

8.1.1 产品出厂检验

产品交货时进行的检验。

8.1.2 产品型式检验

新产品鉴定或国家质检机构质量监督检验。

8.2 检验项目

型式检验的检验项目按 5.2要求进行。出厂检验不检有效期。

8.3 判定规则

8.3.1 合格产品:

a)       检验结果符合 5.2所规定的技术指标的产品为合格产品；

b)       产品有效活菌数符合指标，杂菌率不符合指标，但小于本标准规定的两倍时（液体 10%、固体30%、冻干瓶4%），而且在马丁培养基平板上霉菌数小于30×10 -5 ，其他指标有一项不符合，也可判为合格产品；

c)       产品有效活菌数及杂菌率符合指标，在水分、外观、 pH值、细度等次要检测项目中，有3项不符合技术指标，也判为合格产品。

8.3.2 不合格产品:

a)        产品有效活菌数不符合技术指标或投入菌种没有完全相应的检验出，判为不合格产品；

b)        产品杂菌率超过本标准规定的两倍（液体 10%、固体30%、冻干瓶4%），判为不合格品；

c)        产品有效活菌数符合指标，杂菌率不符合指标，但小于本标准规定的两倍时（液体 10%、固体30%、冻干瓶4%），其他指标有两项不符合，判为不合格产品；

d)        产品检验在马丁培养基平板上霉菌数≥ 30×10 -5 ，判为不合格产品；

e)        产品水分、 pH值、细度、外观等次要检测项目中，有4项不符合技术指标，判为不合格产品。

8.3.3 含有植物促生根际细菌（PGPR）的固氮菌肥料产品检测时，只测固氮菌数量，不测植物促生根际细菌的数量，也不视其为杂菌。

8.3.4 本标准中质量指标合格判断，采用GB/T 1250中修约值比较。

9 包装、标识、运输和贮存

9.1 包装

9.1.1 内包装

液体肥料小包装用塑料瓶或玻璃瓶，大包装用塑料桶。固体肥料用不透明聚乙烯塑料袋包装。冻干菌剂用玻璃指形管真空干燥。

9.1.2 外包装

外包装采用纸箱，纸箱质量应符合 GB/T 6543要求。箱外用尼龙打包带加固。

9.1.3 每箱(袋)产品中附有产品合格证和使用说明书，在使用说明中标明使用方法、用量及注意事项。

9.2 标识

在包装箱 (袋)上印有产品名称、商标、标准编号、肥料登记证号、生产单位、厂址、生产日期、批号和净重，并印有防晒、防潮、防冻等标记，若有必要还要加印易碎、防倒置等标记。内包装上有产品名称、商标、标准编号、肥料登记证号、有效菌含量、生产日期、有效期、产品性能、使用说明书及生产单位、厂址等。

9.3 运输

适用于常用运输工具，运输过程中有遮盖物，防止雨淋、日晒及 35℃以上高温。气温低于0℃时采取保温措施，防止菌肥冻冰。运输过程中轻装轻卸，避免包装破损。

9.4 贮存

产品贮存在阴凉、干燥、通风的库房内，最适温度为 10℃ ~ 25℃，不得露天堆放，以防雨淋和日晒，避免冻冰及长时间35℃以上高温。

附 录 A

(标准的附录)

有效活菌数和杂菌（霉菌）测定的选择培养基

A1、固氮菌用阿须贝（Ashby）培养基

磷酸二氢钾（ KH 2 PO 4 ） 0.2g

硫酸镁（ MgSO 4 ?7H 2 O） 0.2g

氯化纳 (NaCl) 0.2g

碳酸钙 (CaC0 3 ) 5.0g

甘露醇（ C 6 H 14 O 6 ） 10.0g

硫酸钙 (CaS0 4 ?7H 2 O) 0.lg

pH值 7.0

A2、固氮（茎瘤）根瘤菌培养基

乳酸钠（ C 3 H 5 O 3 Na） 10.0g

磷酸氢二钾（ K 2 HPO 4 ） 1.67g

磷酸二氢钾（ KH 2 PO 4 ） 0.87g

氯化纳 (NaCl) 0.05g

氯化钙 (CaCl 2 ) 0.04g

氯化铁 (FeCl 3 ) 0.004g

硫酸镁 (MgS0 4 ?7H 2 0) 0.1g

酵母膏 1.0g

（或酵母粉 0.8g）

pH 6.8

A3、联合固氮菌培养基

D-葡萄糖酸钠（C 6 H 11 O 7 Na） 5.0g

磷酸二氢钾（ KH 2 PO 4 ） 0.4g

磷酸氢二钾（ K 2 HPO 4 ） 0.1g

硫酸镁 (MgS0 4 ?7H 2 0) 0.2g

氯化纳 (NaCl) 0.1g

氯化钙 (CaCl 2 ) 0.02g

氯化铁 (FeCl 3 ) 0.01g

硫酸镁 (MgS0 4 ?7H 2 0) 0.1g

酵母膏 1.0g

（或酵母粉 0.8g）

钼酸钠 (Na 2 Mo0 4 ) 0.002g

pH 6.8~7.0

A4、马丁培养基（测霉菌数）

磷酸氢二钾（ K 2 HPO 4 ） 1.0g

硫酸镁 (MgS0 4 ?7H 2 0) 0.5g

葡萄糖（ C 6 H 12 O 6 ?H 2 0） 10.0g

蛋白胨 5.0g

1%孟加拉红水溶液 3.3mL

[四氯四碘荧光素（C 20 H 4 Cl 4 I 4 O 5 ）]

每升培养基中加入 0.1g氯霉素，一起灭菌。

注：以上各培养基需蒸馏水 1000mL，琼脂18 ~ 20g。

附 录 B

（标准的附录）

染色剂和染色方法

B1 荚膜染色法

B1.1 染色剂

石碳酸复红染色液

甲液：碱性复红 (Basicfuchsin)(C 20 H 20 ClN 3 ) 0.3g

95%酒精 10.0mL

乙液：石碳酸（ C 6 H 5 OH） 5.0g

蒸馏水 95.0mL

a）将碱性复红在研钵中研磨后，逐渐加入95%酒精，继续研磨使之溶解，配成甲液。

b）将石碳酸溶解在蒸馏水中配成乙液。

c）将甲液和乙液混合摇匀，成为石碳酸复红，通常可将混合液稀释5~10倍使用。稀释液容易变质失效，一次不宜多配。

B1.2 染色方法

B1.2.1 取少量培养菌液涂于载玻片水滴中，涂成薄层。

B1.2.2 自然干燥或稍加热。

B1.2.3 在石碳酸复红染1min后，水洗，干后镜检。

B1.3 染色结果

菌体为红色，菌体周围有一层透明圈即为荚膜。

B2 芽胞染色法

B2.1 染色剂

B2.1.1 5%孔雀绿

孔雀绿（ C 23 H 25 ClN 2 ） 5.0g

蒸馏水 100mL

B2.1.2 0.05%碱性复红

碱性复红 (Basicfuchsin)(C 20 H 20 ClN 3 ) 0.5g

95%酒精 100mL

B2.2 染色方法

B2.2.1 制片

B2.2.2 加孔雀绿染液3~5滴于涂片处，酒精灯火焰加热至冒汽，但不沸腾，并随时补加染液，维持涂片处不干，染色约5~10min。

B2.2.3 自来水冲洗30s。

B2.2.4 用0.05%碱性复红染色1min，水洗，镜检（若0.05%碱性复红浓度太高，可根据具体情况适当稀释）。

B2.3 染色结果

芽胞绿色，菌体红色。

B3 革兰氏染色法

B3.1 染色剂

B3.1.1 结晶紫染色液

甲液：结晶紫 2g

乙醇 (95%) 20mL

乙液：草酸镀 0.8g

蒸馏水 80mL

甲、乙液相混合，静置 48h后使用。

B3.1.2 卢哥(Lugol)氏碘液

碘 (I 2 )片 1.0g

碘化钾 (KI) 2.0g

蒸馏水 300mL

先用少量 (3~5mL)蒸馏水溶解碘化钾，再投入碘片，待碘全溶后，加水100mL，配成母液，使用时加两倍水，稀释成卢哥氏碘液。

B3.1.3 脱色液(95%的乙醇)

B3.1.4 复染液(0.5%的番红水溶液)

取 2.5g番红，溶于l00mL无水酒精中。取番红酒精溶液20mL，加入80mL蒸馏水，即成0.5%的番红水溶液。

B3.2 染色方法

B3.2.1 制片

B3.2.2滴加结晶紫液，覆盖1min。

B3.2.3 用水冲净结晶紫液。

B3.2.4 滴加碘液冲去残水，并覆盖约1min。

B3.2.5 用水冲去碘液，用吸水纸吸去水分。

B3.2.6 加95%酒精数滴，并轻轻摇动进行脱色，30s后水洗，吸去水分。

B3.2.7 番红染色液染10s后，自来水冲洗。干燥，镜检。

B3.3 染色结果

革兰氏正反应菌体呈紫色，负反应菌体呈红色。

B4 鞭毛染色

B4.1 染色剂

甲液：单宁酸（ C 76 H 52 O 46 ） 5.0g

氯化铁（ FeCl 3 ） 1.5g

15%甲醛（HCHO） 2.0mL

1%氢氧化钠（NaOH） 1.0mL

蒸馏水 100mL

乙液：硝酸银（ AgNO 3 ） 2g

蒸馏水 100mL

待硝酸银溶解后，取出 10mL备用，其余的90mL硝酸银液中滴加浓氢氧化铵，则形成很厚的沉淀，再继续滴加氢氧化铵到刚刚溶解沉淀成为澄清溶液为止。再将备用的硝酸银慢慢滴入，则出现薄雾，但轻轻摇动后，薄雾状的沉淀又消失，再滴入硝酸银，直到摇动后，仍呈现轻微而稳定的薄雾状沉淀为止（如雾重，则银盐沉淀出，不宜使用）。

B4.2 染色方法

B4.2.1 涂片：在载玻片的一端滴一滴蒸馏水，用接种环挑取斜面上少许菌苔，在载玻片的水滴中轻蘸几下。将玻片稍倾斜，使菌液随水滴缓慢流到另一端，然后平放在空气中干燥。

B4.2.2 涂片干燥后，滴加甲液3~5min，用蒸馏水冲洗。加乙液染30~60s，并在酒精灯上加热，使其稍冒汽而染液不干，然后用蒸馏水冲洗，干后镜检。

B4.3 染色结果

菌体为深褐色，鞭毛为褐色。