| 固 氮 菌 肥 料 |
| NY411-2000 |
| Azotobacter fertilizer |
2000-12-22发布 2001-04-01实施
中华人民共和国农业部 发 布
前 言
本标准在原有标准NY227-1994《微生物肥料》的基础上，对其中的固氮菌肥料部分进行修改。
主要修改内容如下：
—在技术要求中删除成品无害化指标；
—在检验方法中增加允许差，并增加抽样和判定规则。
本标准自实施之日起，同时代替NY227-1994中的固氮菌肥料部分。
本标准的附录A、附录B、附录C都是标准的附录。
本标准由中华人民共和国农业部提出。
本标准起草单位：农业部微生物肥料质量监督检验测试中心、中国农业科学院土壤肥料研究所。
本标准主要起草人：李元芳、吴观以、李慧荃、葛诚、沈德龙。
固氮菌肥料
Azotobacter fertilizer
1 范围
本标准规定了固氮菌肥料的分类、技术要求、检验方法、检验规则、标志、包装、运输、贮存等。
本标准适用于含有益的固氮菌、能在土壤和多种作物根际中固定空气中的氮气,供作物氮素营养,又能分泌激素剌激作物生长的活体制品。本标准也适用于以固氮菌为主的含有能促进固氮、生长的植物促生根际细菌(PGPR)的复合固氮菌肥料。
2 引用标准
下列标准所包含的条文，通过在本标准中引用而构成为本标准的条文。本标准出版时，所示版本均有效。所有标准都会被修订，使用本标准的各方应探讨使用下列标准最新版本的可能性。
GB/T 625一1989 化学试剂 硫酸
GB/T 629一1997 化学试剂 氢氧化钠
GB/T 1250一1989 极限数值的表示方法和判定方法
GB/T 6543一1986 瓦愣纸箱
GB/T 6682一1992 分析实验室用水规格和试验方法
3 定义
本标准采用下列定义：
3.1 自生固氮菌
在土壤里能固定空气中的氮，供作物氮素营养，又能分泌激素刺激作物生长的微生物。
3.2根际联合固氮菌
既依赖根际环境生长，又在根际中固定空气中的氮气，对作物的生长发育产生积极作用的微生物。
3.3 固氮效能
固氮菌每消耗1g碳水化合物（糖）从空气中摄取氮素的毫克数，固氮
效能用mg氮/g糖表示。
4 产品分类
4.1 按形态不同，分为液体固氮菌肥料、固体固氮菌肥料和冻干固氮菌肥料。
4.2 按菌种及特性分为：自生固氮菌肥料、根际联合固氮菌肥料、复合固氮菌肥料。
5 技术要求
5.1 菌种
在含一种有机碳源的无氮培养基中能固定分子氮，并具有一定固氮效能。菌体一般为短杆状（固氮螺菌属菌体呈螺旋状），革兰氏染色阴性。
5.1.1 自生固氮菌
用固氮菌属（Azotobacter）、氮单胞菌属（Azomonas）的菌种，也可用茎瘤根瘤菌（Azorhizobium）和固氮芽孢杆菌（Paenibacillus
azotofixans）的菌株。
5.1.2 根际联合固氮菌
可用下列菌种：固氮螺菌（Azospirillum）；阴沟肠杆菌（Enteroba）经鉴定为非致病菌的菌株；粪产碱菌（Alcaligenes
faecalis）经鉴定为非致病菌的菌株；肺炎克氏杆菌（Klebseilla
pneumoniae）经鉴定为非致病菌的菌株。
使用本准则规定之外的菌种生产固氮菌肥料时，菌种必须经过鉴定，并符合5.1要求。
生产固氮微生物肥料所使用的菌种，必要时还要进行菌种染色鉴别（见附录B）和菌种固氮效能测定（见附录C）。
5.2 成品技术指标(见表1)
表1 成品技术指标
项目 液体 固体 冻干
外观、气味 乳白或淡褐色液体，浑浊，稍有沉淀，无异臭味
黑褐色或褐色粉状，湿润、松散，无异臭味 乳白色结晶，无味
水分，% - 25.0~35.0 3.0
pH值 5.5~7.0 6.0~7.5 6.0~7.5
细度，过孔径0.18mm标准筛的筛余物，% ≤ 2
20.0 -
有效活菌数，个/ml
(个/g、个/瓶 ) ≥ 5.0×108 1.0×108 5.0×108
杂菌率1），% ≤ 5.0 15.0 2.0
有效期2）， 月 ≥ 3 6 12
1） 其中包括10-6马丁培养基平板上无霉菌。
2） 此项仅在监督部门或仲裁检验双方认为有必要时才检测。
6 抽样
按每一发酵罐菌液制成的产品为一批，逐批抽样检验。抽样过程要严格避免杂菌污染。6.1
抽样工具及用品
抽样前预先准备好无菌塑料袋(或塑料瓶)、金属勺、剪刀、封口机(或封口胶带)、牛皮纸封样袋、标签、抽样封条和胶水。
6.2 抽样数量及抽样方法
在成品库抽样，按“”形分层设点抽样，抽样以件为单位，小包装产品以一包装箱为一件。大包装（30-50kg）产品以一袋（或一桶）为一件。抽样基数由样品基数的大小确定。1-10件，全部抽样。11-200件，抽样10件；201-400件，抽取20件。样品基数大于400件，按照超过部分的2%增加抽样件数。总件数不超过40件。
每件小包装产品抽取一小袋，在无菌条件下每袋取样200g。将所有样品混匀，按四分法缩到2000g，分装4袋，然后封口。每2袋为一份装入牛皮纸封样袋。
液体产品每件吸取10mL，一同防入无菌的三角瓶中，混匀后分成两份，每份250mL。冻干产品，每件取一支防入无菌的三角瓶中，加无菌液体培养液，溶解混匀后分成两份，每份50mL。贴上抽样标签和封条（一份被抽样单位留存，一份交检测中心检测）。
7 检验方法
7.1 仪器设备及试剂
7.1.1 仪器设备
生物显微镜（10×100）；
菌落计数器；
恒温培养箱；
恒温干燥箱；
恒温摇床；
灭菌锅；
无菌室或超净工作台；
酸度计；
试管：ф15mm×150mm，ф18mm×180mm；
培养皿：直径9cm；
三角瓶：500mL；
无菌吸管：1、2、5、10mL；
玻璃刮刀；
滤纸；
酒精灯；
标准筛：孔径0.18mm和0.15mm；
1号羊毛画笔；
无菌水；
无离子水。
7.1.2 试剂
选择培养基（附录A）；
刚果红染液（0.5%）。
7.2 成品检验
7.2.1 气味检验
取固氮菌肥料样品打开包装，进行感官检验。
7.2.2 外观检验
将固体固氮菌肥料包装打开，装在白色搪瓷盘中，将液体固氮菌肥料摇匀，在明亮光线下进行感官检验。
7.2.3 pH值测定
液体固氮菌肥料的pH值测定：取供检菌液直接测定pH值，取三次测定结果的平均数。
固体固氮菌肥料的pH值测定：取50mL烧杯一个，加入菌肥25g，无离子水25mL。通过磁力搅拌使溶液均匀后用酸度计测定pH值。取三次测定结果的平均数。
7.2.4 含水量测定
称取固体固氮菌肥料三份，每份20.00g，精确到0.01g，放入已称恒重的铝盒中。置105℃干燥箱内烘烤4h，移至干燥器内，冷却后称重。根据烘干前后质量差按式(l)计算含水量。取三个样品测定数的平均值。平行样品绝对偏差应低于1%。
含水量(%)=（m0-m1）/m0×100 ………………(1)
式中：m0一烘干前样品质量，g
m1一烘干后样品质量，g。
7.2.5 吸附剂颗粒细度测定
称样10.00g(精确至0.01g)，置于标准筛中(直径分别为0.18mm和0.15mm)，用水冲洗，用毛笔轻刷，至粉末不再通过为止。将筛余物置105~110℃温度下烘干，称重。筛余物百分含量按式(2)计算：
筛余物(%)=筛余物质量/（1-样品含水量百分数）/样品质量×100
………(2)
7.2.6 有效活菌数及杂菌率的测定
采用平板计数法测定固氮菌活菌数及杂菌率。
采样应不少于500g，从中抽取10.00g，加入带玻璃珠的100mL的无菌水中(液体菌剂取l0mL加入90mL的无菌水中)，静置20min后在旋转式摇床上200r/min充分振荡30min，即成母液的菌悬液。
用无菌吸管分别吸取5mL上述母液的菌悬液加入45mL无菌水中，混匀成1：10稀释的菌悬液，这样依次稀释，分别得到1：1×102，1：1×103，1：1×104，1：1×105等浓度（每个稀释度必须更换无菌吸管）。
用0.5mL无菌吸管分别吸取不同稀释度菌悬液0.1mL，加至直径为9cm的选择培养基（见附录A）表面，用无菌玻璃刮刀将菌悬液均匀地涂于琼脂表面，或取1mL不同稀释度菌悬液加入培养皿内，与琼脂培养基混匀，每个样品取3个连续适宜稀释度，每一稀释度重复3次，同时加无菌水的空白对照。28℃培养2~3d后每个稀释度取5~10个菌落的菌体，涂片染色（见附录B）。显微镜观察识别后，选一个适宜稀释度（菌落在30~300个之间的平板），计算出同一稀释度三个平皿上菌落平均数。
杂菌数是指在选择培养基上，除有效活菌外的其他种菌的菌落数与马丁培养基上霉菌数之和。马丁培养基10-4稀释度菌悬液加样，操作步骤同样品有效活菌数检测操作。
7.2.6.2 允许差
平行样品误差按式（3）计算，并应符合表2的规定。
………………(3)
表2 平板上菌落数对应的单一标准差
7.2.6.3 测定结果的计算
按式（4）、式（5）计算样品的有效活菌数及杂菌率
有效活菌数（个/g）=菌落平均数×稀释倍数×母液菌悬液的体积/菌剂克数或毫升数/加样量
…………(4)
杂菌率(%)=杂菌总数/（固氮菌数+杂菌总数）×100
…………………(5)
7.2.7有效期检验
在产品说明书标明的有效期到达前10d测定成品各项指标，方法同7.2.1~7.2.6。
8 检验规则
8.1 检验分类
8.1.1 产品出厂检验
产品交货时进行的检验。
8.1.2 产品型式检验
新产品鉴定或国家质检机构质量监督检验。
8.2 检验项目
型式检验的检验项目按5.2要求进行。出厂检验不检有效期。
8.3 判定规则
8.3.1 合格产品:
a) 检验结果符合5.2所规定的技术指标的产品为合格产品；
b)
产品有效活菌数符合指标，杂菌率不符合指标，但小于本标准规定的两倍时（液体10%、固体30%、冻干瓶4%），而且在马丁培养基平板上霉菌数小于30×10-5，其他指标有一项不符合，也可判为合格产品；
c) 产品有效活菌数及杂菌率符合指标，在水分、外观、pH值、细度等次要检测项目中，有3项不符合技术指标，也判为合格产品。
8.3.2 不合格产品:
a) 产品有效活菌数不符合技术指标或投入菌种没有完全相应的检验出，判为不合格产品；
b) 产品杂菌率超过本标准规定的两倍（液体10%、固体30%、冻干瓶4%），判为不合格品；
c)
产品有效活菌数符合指标，杂菌率不符合指标，但小于本标准规定的两倍时（液体10%、固体30%、冻干瓶4%），其他指标有两项不符合，判为不合格产品；
d) 产品检验在马丁培养基平板上霉菌数≥30×10-5，判为不合格产品；
e) 产品水分、pH值、细度、外观等次要检测项目中，有4项不符合技术指标，判为不合格产品。
8.3.3 含有植物促生根际细菌（PGPR）的固氮菌肥料产品检测时，只测固氮菌数量，不测植物促生根际细菌的数量，也不视其为杂菌。
8.3.4 本标准中质量指标合格判断，采用GB/T
1250中修约值比较。
9 包装、标识、运输和贮存
9.1 包装
9.1.1 内包装
液体肥料小包装用塑料瓶或玻璃瓶，大包装用塑料桶。固体肥料用不透明聚乙烯塑料袋包装。冻干菌剂用玻璃指形管真空干燥。
9.1.2 外包装
外包装采用纸箱，纸箱质量应符合GB/T 6543要求。箱外用尼龙打包带加固。
9.1.3 每箱(袋)产品中附有产品合格证和使用说明书，在使用说明中标明使用方法、用量及注意事项。
9.2 标识
在包装箱(袋)上印有产品名称、商标、标准编号、肥料登记证号、生产单位、厂址、生产日期、批号和净重，并印有防晒、防潮、防冻等标记，若有必要还要加印易碎、防倒置等标记。内包装上有产品名称、商标、标准编号、肥料登记证号、有效菌含量、生产日期、有效期、产品性能、使用说明书及生产单位、厂址等。
9.3 运输
适用于常用运输工具，运输过程中有遮盖物，防止雨淋、日晒及35℃以上高温。气温低于0℃时采取保温措施，防止菌肥冻冰。运输过程中轻装轻卸，避免包装破损。
9.4 贮存
产品贮存在阴凉、干燥、通风的库房内，最适温度为10℃~25℃，不得露天堆放，以防雨淋和日晒，避免冻冰及长时间35℃以上高温。
附 录 A
(标准的附录)
有效活菌数和杂菌（霉菌）测定的选择培养基
A1、固氮菌用阿须贝（Ashby）培养基
磷酸二氢钾（KH2PO4） 0.2g
硫酸镁（MgSO4?7H2O） 0.2g
氯化纳(NaCl) 0.2g
碳酸钙(CaC03) 5.0g
甘露醇（C6H14O6） 10.0g
硫酸钙(CaS04?7H2O) 0.lg
pH值 7.0
A2、固氮（茎瘤）根瘤菌培养基
乳酸钠（C3H5O3Na） 10.0g
磷酸氢二钾（K2HPO4） 1.67g
磷酸二氢钾（KH2PO4） 0.87g
氯化纳(NaCl) 0.05g
氯化钙(CaCl2) 0.04g
氯化铁(FeCl3) 0.004g
硫酸镁(MgS04?7H20) 0.1g
酵母膏 1.0g
（或酵母粉 0.8g）
pH 6.8
A3、联合固氮菌培养基
D-葡萄糖酸钠（C6H11O7Na） 5.0g
磷酸二氢钾（KH2PO4） 0.4g
磷酸氢二钾（K2HPO4） 0.1g
硫酸镁(MgS04?7H20) 0.2g
氯化纳(NaCl) 0.1g
氯化钙(CaCl2) 0.02g
氯化铁(FeCl3) 0.01g
硫酸镁(MgS04?7H20) 0.1g
酵母膏 1.0g
（或酵母粉 0.8g）
钼酸钠(Na2Mo04) 0.002g
pH 6.8~7.0
A4、马丁培养基（测霉菌数）
磷酸氢二钾（K2HPO4） 1.0g
硫酸镁(MgS04?7H20) 0.5g
葡萄糖（C6H12O6?H20） 10.0g
蛋白胨 5.0g
1%孟加拉红水溶液 3.3mL
[四氯四碘荧光素（C20H4Cl4I4O5）]
每升培养基中加入0.1g氯霉素，一起灭菌。
注：以上各培养基需蒸馏水1000mL，琼脂18~20g。
附 录 B
（标准的附录）
染色剂和染色方法
B1 荚膜染色法
B1.1 染色剂
石碳酸复红染色液
甲液：碱性复红(Basicfuchsin)(C20H20ClN3)
0.3g
95%酒精 10.0mL
乙液：石碳酸（C6H5OH） 5.0g
蒸馏水 95.0mL
a）将碱性复红在研钵中研磨后，逐渐加入95%酒精，继续研磨使之溶解，配成甲液。
b）将石碳酸溶解在蒸馏水中配成乙液。
c）将甲液和乙液混合摇匀，成为石碳酸复红，通常可将混合液稀释5~10倍使用。稀释液容易变质失效，一次不宜多配。
B1.2 染色方法
B1.2.1 取少量培养菌液涂于载玻片水滴中，涂成薄层。
B1.2.2 自然干燥或稍加热。
B1.2.3 在石碳酸复红染1min后，水洗，干后镜检。
B1.3 染色结果
菌体为红色，菌体周围有一层透明圈即为荚膜。
B2 芽胞染色法
B2.1 染色剂
B2.1.1 5%孔雀绿
孔雀绿（C23H25ClN2） 5.0g
蒸馏水 100mL
B2.1.2 0.05%碱性复红
碱性复红(Basicfuchsin)(C20H20ClN3) 0.5g
95%酒精 100mL
B2.2 染色方法
B2.2.1 制片
B2.2.2 加孔雀绿染液3~5滴于涂片处，酒精灯火焰加热至冒汽，但不沸腾，并随时补加染液，维持涂片处不干，染色约5~10min。
B2.2.3 自来水冲洗30s。
B2.2.4 用0.05%碱性复红染色1min，水洗，镜检（若0.05%碱性复红浓度太高，可根据具体情况适当稀释）。
B2.3 染色结果
芽胞绿色，菌体红色。
B3 革兰氏染色法
B3.1 染色剂
B3.1.1 结晶紫染色液
甲液：结晶紫 2g
乙醇(95%) 20mL
乙液：草酸镀 0.8g
蒸馏水 80mL
甲、乙液相混合，静置48h后使用。
B3.1.2 卢哥(Lugol)氏碘液
碘(I2)片 1.0g
碘化钾(KI) 2.0g
蒸馏水 300mL
先用少量(3~5mL)蒸馏水溶解碘化钾，再投入碘片，待碘全溶后，加水100mL，配成母液，使用时加两倍水，稀释成卢哥氏碘液。
B3.1.3 脱色液(95%的乙醇)
B3.1.4 复染液(0.5%的番红水溶液)
取2.5g番红，溶于l00mL无水酒精中。取番红酒精溶液20mL，加入80mL蒸馏水，即成0.5%的番红水溶液。
B3.2 染色方法
B3.2.1 制片
B3.2.2滴加结晶紫液，覆盖1min。
B3.2.3 用水冲净结晶紫液。
B3.2.4 滴加碘液冲去残水，并覆盖约1min。
B3.2.5 用水冲去碘液，用吸水纸吸去水分。
B3.2.6 加95%酒精数滴，并轻轻摇动进行脱色，30s后水洗，吸去水分。
B3.2.7 番红染色液染10s后，自来水冲洗。干燥，镜检。
B3.3 染色结果
革兰氏正反应菌体呈紫色，负反应菌体呈红色。
B4 鞭毛染色
B4.1 染色剂
甲液：单宁酸（C76H52O46） 5.0g
氯化铁（FeCl3） 1.5g
15%甲醛（HCHO） 2.0mL
1%氢氧化钠（NaOH） 1.0mL
蒸馏水 100mL
乙液：硝酸银（AgNO3） 2g
蒸馏水 100mL
待硝酸银溶解后，取出10mL备用，其余的90mL硝酸银液中滴加浓氢氧化铵，则形成很厚的沉淀，再继续滴加氢氧化铵到刚刚溶解沉淀成为澄清溶液为止。再将备用的硝酸银慢慢滴入，则出现薄雾，但轻轻摇动后，薄雾状的沉淀又消失，再滴入硝酸银，直到摇动后，仍呈现轻微而稳定的薄雾状沉淀为止（如雾重，则银盐沉淀出，不宜使用）。
B4.2 染色方法
B4.2.1
涂片：在载玻片的一端滴一滴蒸馏水，用接种环挑取斜面上少许菌苔，在载玻片的水滴中轻蘸几下。将玻片稍倾斜，使菌液随水滴缓慢流到另一端，然后平放在空气中干燥。
B4.2.2
涂片干燥后，滴加甲液3~5min，用蒸馏水冲洗。加乙液染30~60s，并在酒精灯上加热，使其稍冒汽而染液不干，然后用蒸馏水冲洗，干后镜检。
B4.3 染色结果
菌体为深褐色，鞭毛为褐色。 |
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