| 光合细菌肥料 |
| NY 527-2002 |
Inoculant of Photosynthetic bacteria
2002-08-27发布 2002-12-01实施
中华人民共和国农业部 发 布
前 言
本标准的附录A、B是规范性附录。
本标准由中华人民共和国农业部种植业管理司提出。
本标准由中华人民共和国农业部批准。
本标准由农业部微生物肥料质量监督检验测试中心负责起草。
本标准主要起草人：姜昕 曹凤明 樊蕙 李力 韩永锋
饶汉东
光合细菌菌剂
1 范围
本标准规定了光合细菌制剂的分类、技术要求、检验方法、检验规则、标志、包装、运输及贮存。
本标准适用于以紫色非硫细菌（Purple Nonsulfur
Bacteria）中所属的一种或多种光合细菌为菌种，采用有机、无机原料，经发酵培养而成的光合细菌活菌制品。
2 规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。
GB 4789.3 食品微生物学检验 大肠菌群测定
GB 7959 粪便无害化卫生标准
GB/T 14539.1 复混肥料中砷、镉、铅的测定
GB/T 14539.2 复混肥料中砷的测定方法
GB/T 14539.3 复混肥料中镉的测定方法
GB/T 14539.4 复混肥料中铅的测定方法
GB/T 15555.1 固体废物 总铬的测定 二苯碳酰二肼分光光度法
GB/T 15555.5 固体废物 总汞的测定 冷原子吸收分光光度法
NY 227 微生物肥料
NY 411 固氮菌肥料
NY 413 硅酸盐细菌肥料
3 产品分类
3.1 液体菌剂：以有机、无机原料培养液接种光合细菌，3.2 经发酵培养而3.3 成的光合细菌菌液。
3.4 固体菌剂：由某种固体物质作为载体吸附光合细菌菌液而3.5 成。
4 要求
4.1 菌种
生产光合细菌菌剂所使用的菌种，都必须经过农业部认定的国家级科研单位的鉴定，包括菌种属及种的学名、形态、生理生化特性及鉴定依据、活性、安全性等完整资料。以杜绝一切植物检疫对象、传染病病原作为菌种生产的产品。
4.2 产品指4.3 标4.4
4.4.1 产品技术指4.4.2 标4.4.3 见表1。
表1 光合细菌菌剂技术指标
项目剂 型
液 体粉 剂颗 粒
外观、气味紫红色、褐红色、暗红色、棕红色、棕黄色等液体，略有沉淀、略具清淡的腥味粉末状、略具清淡的腥味颗粒状、略具清淡的腥味
pH值6.0~8.56.0~8.56.0~8.5
水分，%—20.0~35.05.0~15.0
细度筛余物，%
孔径0.18mm
孔径1.00mm~4.75mm—
—≤20.0
——
≤20.0
有效活菌数，个/mL
（个/g） ≥5.0×1082.0×1081.0×108
杂菌率，% ≤10.015.020.0
霉菌杂菌 106/g(mL) ≤3.03.03.0
有效期不得低于6个月不得低于6个月不得低于6个月
蛔虫卵死亡率(%) ≥95
粪大肠菌群 个/g(mL) ≤100
注：有效期仅在监督部门或仲裁双方认为有必要时才检验
4.4.4 五种重金属限量指4.4.5 标4.4.6 见表2。
表2 五种重金属限量指标
参数 标准极限
汞及化合物（以Hg计）mg/kg≤5
镉及化合物（以Cd计）mg/kg≤10
铬及化合物（以Cr计）mg/kg≤150
砷及化合物（以As计）mg/kg≤75
铅及化合物（以Pb计）mg/kg≤100
注：液体菌剂可免作重金属检测
5 抽样
5.1 按每一发酵罐菌液制成的产品为一批，5.2 采用随机方法对某一批次或不同5.3 批次产品进行抽样检验。抽样过程严格避免杂菌污染。
5.4 抽样工具及用品
抽样前预先准备好无菌塑料袋（或塑料瓶）、金属勺（或量筒）以及剪刀、封口机、封样袋、胶水、抽样封条等。
5.5 抽样方法及抽样数量
在成品库抽样，小包装（2kg/袋或2000mL/瓶以下）产品以一个包装箱为一件，在同一批次的产品中随机抽取3件，每件中抽取1袋（或1瓶）。大包装（2kg/袋或2000mL/桶以上）产品一袋/桶为一件，在同一批次产品中随机抽取3件，从每件中取样1000g（mL），并将所取样品混匀，然后装取3袋(瓶)，每袋不少于500g或每瓶不少于500mL。将抽取的同一批次的3份样品分别装入封样袋，贴上抽样封条。一份留被抽样单位，二份交抽样单位。
6 检测方法
6.1 仪器设备6.2 及试剂
6.2.1 仪器设备6.2.2
烧杯；
酸度计；
电子天平；
土壤铝盒；
恒温干燥箱；
干燥器；
试验筛：孔径0.18mm、1.0mm和4.5mm；
无菌室或洁净工作台；
酒精灯；
蒸汽消毒器；
显微镜；
光照培养箱；
摇床；
恒温培养箱；
玻璃仪器：灭菌的螺口试管、1mL、5mL、10mL移液管、三角瓶、平皿、刮刀。
6.2.3 试剂
无离子水、蒸馏水、无菌水；
培养基（遵照附录A的规定）。
6.3 外观及气味检验：
液体样品装在小烧杯中，固体样品装在白色搪瓷盘中，在明亮光线下进行感官检验。
6.4 pH值测定：
应符合NY413中7.2.3的规定。
6.5 水分测定：
应符合NY413中7.2.4的规定。
6.6 细度检验
应符合NY413中7.2.5的规定。
6.7 有效活菌数的测定
有效活菌数的测定遵照附录B的规定。
6.8 杂菌率的测定（好氧或兼性厌氧杂菌）
从用来测定有效活菌数且已经过10倍系列稀释的样品中，选取3个连续适宜稀释度进行杂菌率测定。平板测数法，按NY227-1994中5.2操作。
6.9 有效期的检验
在产品说明书中标明的有效期到达前三周，按4.2.1所列项目对产品进行检验。
6.10 粪大肠菌群值的测定
应符合GB4789.3的规定。
6.11 蛔虫卵死亡率测定。
应符合GB 7959 的规定。
6.12五种重金属测定
6.12.1砷含量测定
应符合GB/T 14539.2的规定。
6.12.2镉含量测定
应符合GB/T 14539.3的规定。
6.12.3铅含量测定
应符合B/T 14539.4的规定。
6.12.4铬含量测定
应符合GB/T 15555.1的规定。
6.12.5汞含量测定
应符合GB/T 15555.5的规定。
7 检验规则
本标准中产品质量指标合格判定，采用GB/T 1250中修约值比较法；数字修约按GB/T
8170进行。
7.1 检验分类
7.1.1 出厂检验（交收检验）
产品出厂时，须由生产厂的质量检验部门，按表4.2.1规定的技术指标进行检验，检验合格并签发质量合格证的产品，方可出厂。出厂检验时不检有效期。
7.1.2 型式检验（例行检验）
一般情况下，一个季度进行一次。有下列情况之一者，也需要进行型式检验。
a)新产品鉴定；
b)产品的工艺、材料等有较大改变与变化；
c)出厂检验结果与上次型式检验有较大差异；
d)国家质量监督机构进行抽查或产品登记检验。
7.2 判定规则
7.2.1 合格产品：具下列任何一条款者，均为合格产品。
a)检验结果全部技术指标都符合标准要求的产品；
b)在产品的外观、pH值、水分、细度等非关键指标检测项目中，有二项（含）以下不符合技术指标，但其它指标符合标准要求。
c)产品其有效活菌数符合技术指标，而杂菌率超过标准的规定，但小于标准规定的二倍时，在产品的外观、pH值、水分、细度等非关键指标检测项目中不超过一项不合格者。
7.2.2 不合格产品：具下列任何一条款者，均为不合格产品。
a)有效活菌数不符合技术指标；
b)杂菌率超过标准规定的二倍；
c)霉菌杂菌超过标准的规定；
d)粪大肠菌群指标不合格；
e)蛔虫卵死亡率指标不合格；
f)重金属中任一项超标；
g)产品的外观、pH值、水分、细度等次要检测项目中有三项不符合技术指标。
8 包装、标9 识、运输与贮存
应符合NY 411中9.1、9.2、9.3和9.4的规定。
附 录 A
（规范性附录）
测定有效活菌数及杂菌率的培养基*1）
A.1 有效活菌数测定的培养基配方
溶液Ⅰ： 溶液Ⅱ：
CaCl275 mg酵母膏2.0 g KH2PO4600 mg
NaAC1.6 g硫胺素40 mg K2HPO43H2O1.18 g
烟酸40 mgMgCl2200 mg 蒸馏水200 mL
NH4Cl1.5 gEDTA-Fe溶液5 mL
生物素40 mg微量元素溶液1 mL
蒸馏水800 mL
将溶液Ⅰ、溶液Ⅱ分别于121℃（kg/cm2）高压灭菌15min，冷却后将溶液Ⅰ、溶液Ⅱ混匀。
微量元素溶液： EDTA-Fe溶液：
EDTA-2Na2.0 gFeSO47H2O2.0 g EDTA-2Na20.0
g
H3BO3100 mgCoCl26H2O100 mg FeSO47H2O20.0
g
ZnCl2100 mgMnCl24H2O100 mg 蒸馏水1000 mL
Na2MoO42H2O20 mgNiCl26H2O20 mg
CuCl22H2O10 mgNa2SeO31 mg
蒸馏水1000 mL
A.2 有效活菌数测定的培养基配方
蛋白胨3.0 gMgSO47H2O0.5 g蒸馏水1000 mL
酵母膏3.0 gCaCl20.3 gpH6.8
A.3 有效活菌数测定的培养基配方
乙酸钠1640 mgCaCl22H2O75 mg微量元素溶液1
mL
MgSO47H2O200 mgEDTA20 mg无离子水1000 mL
K2HPO4900 mg(NH4)2SO41320 mgpH6.8
KH2PO4600 mgFeSO47H2O11.8 mg
微量元素溶液：
H3BO3280 mgNa2MoO42H2O75 mgZnSO47H2O24 mg
Cu(NO3)23H2O4 mgMnSO44H2O210 mg无离子水100
mL
A.4 肉汤培养基（测好氧或兼性厌氧细菌杂菌）：
牛肉膏3.0 g蛋白胨10.0 gNaCl 5.0 g
琼脂18~20 g蒸馏水1000mLpH7.0~7.2
A.5 马丁培养基（测霉菌数）：
KH2PO41.0 gMgSO47H2O0.5 g蒸馏水1000 mL
C6H12O6H2O10.0 g蛋白胨5.0 g
1%孟加拉红水溶液3.3 mL琼脂18~20 g
每1000 mL培养基中加入0.1 g氯霉素共同灭菌。
附 录 B
（规范性附录）
有效活菌数的测定
B.1 有效活菌数的测定步骤（MPN5管法）：
B.1.1
用无菌移液管吸取待测样品10.0mL或称取固体样品10.0g，加入到带玻璃珠的装有90mL（固体需100mL）无菌水的三角瓶中，放置于摇床上充分振荡30min，摇床转速为200r/min，这样得到1:101稀释的菌悬液。
B.1.2
用无菌移液管吸取5.0mL上述菌悬液加入到装有45mL无菌水的三角瓶中，充分振荡摇匀，得到1:102稀释的菌悬液，依此方法制成1:103、1:104、1:105、1:106、1:107、1:108、1:109、1:1010……稀释的菌悬液。
B.1.3
用1mL无菌移液管分别吸取1:106、1:107、1:108、1:109、1:1010五个稀释度的菌悬液1mL（每个稀释度必须更换无菌移液管），加入到预先制备好的盛有9mL无菌培养基的螺口管中，每一稀释度重复接5支试管，接种后立即拧紧塑料帽并摇匀。每个待测样品要同时接种25支盛有培养基的螺口试管（5个稀释度，每一稀释度接种5支螺口试管）。
B.1.4
将以上已接种的螺口试管连同5支盛有无菌培养基的对照管置于光照培养箱内，连续光照培养，光强1000~3000lx，并保持28℃~32℃,培养期间要经常转动螺口试管，以使光照均匀，培养10~12d后，统计出现光合细菌生长的（培养液颜色应符合4.2.1）试管数。
B.2 有效活菌数的计算
根据出现光合细菌生长的阳性试管数，查表“MPN（最大可能数），log10MPN表”（表B1）即可计算出光合细菌的有效活菌数，以亿个/mL或亿个/g表示。
计算方法：利用以下公式计算原菌液的最大可能数。
1mL（g）样品中的菌数=菌数近似值×数量指标第一位数的稀释倍数
例如，某批菌剂测得的光合细菌的结果是，接种1:108稀释度的5支试管全部出现生长，接种1:109稀释度的5支试管中有2支试管为阳性，接种1:1010稀释度的5支试管全部为阴性，即检验结果为5-2-0，查表得知相当于第一稀释管1mL的最大可能数（MPN）为4.9,则该被测菌剂含菌数为4.9×108个/mL（g）。
当实际应用时，必须包含所有试管都生长的稀释倍数直到全部都不生长的稀释倍数，因此，要选择适宜的5个连续稀释倍数的稀释液进行接种。在这些稀释倍数中，如何求MPN值，可作如下处理：
在全部5支试管中均出现生长的稀释度中，把出现生长的稀释度倍数最高的那一级放入数列。例如：为5-5-3-0-0时，则取5-3-0数列。
在全部5支试管中均不出现生长的稀释度中，把稀释度倍数最低的那一级放入数列。例如：为5-3-0-0-0时，则取5-3-0数列。
如果应用上述两条规则，会出现采用如5-5-4-3-0这样的4个等级的稀释度的情况。此时，可先取前面的5-4-3数列，后取4-3-0数列，分别求出log10MPN，然后算出其真数的平均值。在此列中，数列5-4-3的log10MPN为1.447，数列4-3-0的log10MPN为0.431+1（后一数列与前一数列相应稀释了10倍，故要加1进行校正），（1.447+1.431）/2=1.439,所以MPN=27.5。
若待测样品中光合细菌的含量较低，而1:106、1:107、1:108、1:109、1:1010五个稀释度的菌悬液不适宜测定，则可选则稀释倍数低的菌悬液接种测定。
表B.1 MPN，log10MPN表(10倍稀释，5支试管中各接种1毫升)
阳性试管数 MPN（相当于第一稀释管1mL）lgMPN阳性试管数MPN（相当于第一稀释管1mL）lgMPN
第一
稀释管第二
稀释管第三
稀释管第一
稀释管第二
稀释管第三
稀释管
0000-5002.30.362
0100.180.255-15013.10.491
1000.200.301-15103.30.519
1100.400.602-15114.60.663
2000.450.653-15204.90.690
2010.680.833-15217.00.845
2100.680.833-15229.50.978
2200.930.968-15307.90.898
3000.780.892-153111.01.041
3011.10.04153214.01.146
3101.10.04154013.01.114
3201.40.14654117.01.230
4001.30.11454222.01.342
4011.70.23054328.01.447
4101.70.23055024.01.380
4112.10.32255135.01.544
4202.20.34255254.01.732
4212.60.41555392.01.964
4302.70.431554160.02.204
5002.30.362555>180.0>2.255
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