1 应用范围

本法适用于含有雌性激素的各类化妆品。测定范围0～75?g/ml，最低检出浓度，雌二醇为0.258µg/g,雌酮为0.234µg/g。

2 原理

氢氧化钠与化妆品中的油脂进行皂化反应，用石油醚除去剩余的油脂和蜡等干扰物质。雌二醇和雌酮游离溶解在氢氧化钠溶液中，被二氯甲烷萃取，通过高效液相色谱进一步分离并定量测定。

3 试剂

3.1 雌二醇、雌酮混合标准储备溶液：精确称取雌二醇和雌酮各10.000mg,用无水乙醇溶解并稀释至100ml,1ml含雌二醇、雌酮各100.0?g。

3.2 溶剂:乙腈、二氯甲烷、乙酸乙酯、已烷、石油醚均为分析纯，无水乙醇为优级纯。

3.3 5%氢氧化钠溶液。

4 仪器

4.1 高效液相色谱仪：美国Waters分司810系列（HPLC）具510型 泵，UOK进样器和490E紫外-可见光检测器。

4.2 PT系列处理小柱（硅胶柱）：津杨滤材厂（河北省）。

5 分析步骤

5.1 样品预处理

称取1g样品于小烧杯中,加10ml 5%氢氧化钠溶液,充分搅拌溶解后,倾入分液漏斗,用5ml 5%氢氧化钠溶液洗烧杯一次,倾入分液漏斗。

加20ml石油醚^（1）萃取1min，分层后将醚层倾入另一分液漏斗，反复萃取三次，合并醚层并加5ml 5%氢氧化钠溶液洗醚层一次，弃醚层。

合并氢氧化钠层，加10ml二氯甲烷萃取1min，分层后放出二氯甲烷于蒸发皿中，萃取三次，合并二氯甲烷层并蒸发近干，残渣用2ml无水乙醇溶解，必要时离心分离，此溶液为样品A。

氢氧化钠层用盐酸凋pH值到5以下^（2），加10ml二氯甲烷萃取1min分层后，放出二氯甲烷于蒸发皿中，反复萃取三次，弃氢氧化钠层，合并二氯甲烷，蒸干。残渣用2ml无水乙醇溶解，离心分离，上清液为样品B。合并A、B液，浓缩至2ml作为待测溶液。

当样品中干扰物质含量较高时，用硅胶色谱预处理小柱进行净化。将待测溶液注入硅胶柱，吸附后先用10～20ml已烷+乙酸乙酯（95+5）将极性较弱的干扰物质洗脱下来，然后用15ml已烷+乙酸乙酯（50+50），将雌酮、雌二醇洗脱下来，洗脱率为75～100%。

5.2色谱条件

色谱柱：HP ODS200mm×4.6mm。

流动相：乙腈+水（36+64）。

流速：1.6m1／min。

检测器： Waters 490E紫外可见光检测器。

检测波长： 280nm。

保留时间：雌二醇9.01min，雌酮14.07min。

5.3 定性

吸取雌酮、雌二醇标准溶液20µl注入HPLC，记录保留时间。吸取待测溶液20?l注入HPLC，记录保留时间，和标准保留时间比较进行定性。

5.4 定量

5.4.1 标准曲线

取1.0、2.0、4.0、5.0ml雌酮、雌二醇标准贮备液于50ml容量瓶中，用无水乙醇稀释至刻度，分别取20µl注入色谱仪，绘制峰高一浓度标准曲线。

5.4.2 测定

取待测溶液20?l注入色谱仪，记录峰高，由标准曲线求出样品中雌酮、雌二醇的浓度A（µg/ml）。

6 计算

c=A×V/m

式中：
c－一雌酮、雌二醇的含量，µg/g；

A一一由标准曲线查出的样品中雌酮、雌二醇的浓度，µg/m1；

V－一样品溶液总体积，m1；

M－一样品质量，g。

7 精密度和准确度

单个实验室测定膏霜类、生发类和丰乳类样品14件，加入不同浓度的雌二醇和雌酮标准溶液，充分混合后，按本法测定，回收率为80～100％。

当雌二醇和雌酯浓度各为10µg／g时，雌二醇标准偏差为0.43，雌酮为0.36，相对标准偏差分别为6.1％和5.2％（n=7）。

注解：

（1）如果石油醚乳化，加少量丙酮，如果乳化严重，必须重称样品，加氯仿并加热溶解，过滤，挥发除去氯仿，残渣用2ml乙醇溶解，加20ml 5%氢氧化钠溶液转入分液漏斗，以下步骤同前。

（2）雌二醇具有羟基，呈弱酸性，当pH大于11的碱性溶液中，二氯甲烷萃取雌二醇回收率为40%以下，雌酮80%，因此在碱性条件下萃取后，将溶液pH调至酸性（pH13～5）再萃取雌二醇，二次萃取总回性率为80～100%