1 应用范围

本法适用于化妆品中雌性激素、雄性激素和孕激素的测定。本法最低检测量为0．3µg。

2 原理

化妆品中性激素用有机溶剂提取后，高效液相色谱测定，经保留时间定性，标准品峰高定量。

3 试剂

所用试剂除另有说明外，均为优级纯，水指蒸馏水。

3.1 甲醇。

3.2 饱和氯化钠溶液。

3.3 环乙烷。

3.4 2%(V/V)硫酸溶液。

3.5 激素标准溶液。

3.5.1 雌激素⁽¹⁾标准溶液:分别称取0.200g雌酮（Oestrone）、雌二醇（Oestradiol）、雌三醇（（Oetriol）、己烯雌酚（Diethylstilbestrol），用少量甲醇（3.1）溶解,移至100ml容量瓶中,用甲醇稀释至刻度。1ml此溶液含以上四种雌激素各2.0mg。移取1.00ml上述标准溶液于100ml容量瓶中,用甲醇(3.1)稀释到刻度。1ml此溶液含以上四种雌激素各20?g。

3.5.2 雄激素⁽¹⁾标准溶液:分别称取0.600g睾丸酮、用少量甲醇（3.1）溶解,移到100ml容量瓶中,用甲醇稀释至刻度。1ml此溶液含以上二种雄激至少各6.0mg。移取10.00ml此标准溶液于100ml容量瓶中,用甲醇(3.1)稀释到刻度,1ml此溶液含以上二种雄激素各600µg。

3.5.3 孕激素⁽¹⁾标准溶液:称取0.600g报刊酮,用少量甲醇(3.1)溶解,移至100ml容量瓶中,用甲醇稀释到刻度。1ml此溶液含孕激素6.0mg。移取10.0ml此标准溶液于100ml容量瓶中,用甲醇(3.1)稀释到刻度。1ml此溶液含孕激素600?g。

3.5.4 分别移取5.0ml雌激素稀释溶液(3.5.1),5.0ml雄激素稀释溶液(3.5.2)和5.0ml孕激素稀释溶液(3.5.3)于100ml容量瓶中,用甲醇(3.1)稀释到刻度。1ml此溶液分别含四种雌激素1.0µg、二种雄激素30µg、孕激素30?g。

4 仪器

4.1 高效液相色谱仪,具等容泵、紫外检测器及荧光检测器。

4.2 离心机。

5 分析步骤

5.1 样品预处理

5.1.1 液状样品:准确称取1～2g样品于10ml比色管中,在水浴上将有机溶剂挥发至近干,用甲醇稀释到10ml备用。

5.1.2 膏状、乳状样品：准确称取1～2g样品于100ml三角瓶中，在水浴上将有机溶剂挥发至近干。分别加入50ml饱和氯化钠溶液（3.2）⁽²⁾、2ml2%硫酸溶液（3.4）振荡溶解后转移至100ml分液漏斗中,以30ml环已烷(3.3)分三次萃取(必要时离心分离)。合闰一半已烷并在水浴上挥干，用甲醇（3.1）溶解残留物转移到10ml比色管中,并稀释到刻度备用。

5.2 色谱条件

色谱柱:C₁₈柱⁽³⁾。

紫外检测波长:254nm⁽⁴⁾。

荧光检测激发波长：280nm，发射波长：310nm。

流动相：甲醇+水（80+20）。

流速：1ml/min。

5.3 标准曲线

移取0、1．0、2．0、5．0ml激素标准溶液（3．5.4）于l0ml比色管中，用甲醇（3．1）稀释到刻度。取5µl注入高效液相色谱仪。测量标准溶液峰高，绘制工作曲线。

5.4 测定

取待测溶液5µl注入高压色谱仪，根据峰的保留时间定性。测量峰高，从曲线上查出样品中激素的浓度。

6 计算

激素浓度(µg/g)＝A/m×10

式中：
A——从曲线上查出样品中激素浓度，?g/m1；

m——样品质量，g。

7 准确度度和精密度

本方法加标回收率92．4～106．O％，相对标准偏差为2．5％。

注解：

（1）性激素指雄激素、雌激素及孕激素三类。化妆品卫生标准规定此三类激素为禁用物质。

天然性激都是类固醇激素,基本结构见图2-3-52。各种性激素的结构是在此基本构型的C₃、C₅、C₁₀、C₁₆、和C₁₇上的氢被羟基、羰基、甲基所取代。

（2）性激素多不溶于水，而溶于醇、醚、烷等有机溶剂。加入氯化钠起盐析作用，以有利于环已烷从酸性样品混合物中萃取性激素。各性激素的溶解性见表2-3-36。

（3）本标准使用C₁₈反相色谱柱，出峰按A环结合物、D环结合物顺序流出。雌激素的出峰顺序雌三醇、雌二醇、雌酮。除C₁₈反相色谱柱外，也可用填充化学修饰的纤维素或硅胶季铵盐键合剂的阴离子交换柱。由于国内C₁₈柱较普遍、易于购得。故本方法使用C₁₈柱。

（4）雌激素A环为苯环，在254nm和280nm有较强的紫外吸收。睾丸酮和孕酮在254nm也有强吸收，30ng即可检出。

表 2-3-36 各性激素的溶解度