天然激素是由内分泌腺细胞和具有内分泌机能的一些组织所合成的一种量微而生理效应很强的有机化合物。口服避孕药和可的松皮质激素类药物为人工合成品。

化妆品中添加激素能促进毛发生长，防止皮肤老化，有除皱、增加皮肤弹性等作用，但长久使用含激素的化妆品有致癌性。国际癌症研究中心（IARC）已证明己烯雌酚能引起细胞癌、子宫内膜癌、乳腺癌和卵巢癌。1987年我国化妆品卫生标准GB7916一87中规定下列激素均为禁用物质。因此，化妆品中激素的检验对提高化妆品产品质量，保障人民身体健康具有非常重要的意义。

1 激素的分类及理化特性

激素按化学结构分为含氮激素和类固醇激素（或称为甾体激素）。前者有正肾上腺素、异丙肾上腺素等，后者有性激素和肾上腺皮质激素。

类固醇激素从结构上又分为三类。

其中以18个碳原子雌烃为基本结构构型的类固醇激素（图2-3-45），主要有雌二醇、雌三醇、雌酮及人工合成的炔雌醇、己烯雌酚等。其次是以19个碳原子雄烃为基本结构构型的类固醇(图2-3-46),主要有雄酮、睾丸酮、异雄酮、脱氢异雄酮及人工合成甲基睾丸酮等。还有以21个碳原子孕烃为基本结构构型的类固醇激素（图2-3-47），主要包括孕激素中孕酮、孕二醇、人工合成的口服避孕药如炔诺酮及肾上腺皮质激素中的可的松、强的松、泼尼松、肤轻松等。以此三种构型为基础的衍生的各种类固醇激素的分子结构式分别见图2-3-48、图2-3-49、图2-3-50、图2-3-51。

由图不难看出，在类固醇激素碳环的基本结构17位处（C₁₇）有一个羰基或羟基，或一个被取代的二碳支链；3位处（C₃）都有羟基或羰基，A环上有一个不饱和羰基，若被饱和，生理活性完全消失。这是激素在体内失去活性的一般机制。被还原的激素，3位（C₃）和5位（C₅）的碳原子变成不对称碳，因此，每种激素都有四种完全被还原的几何异构体。羰基经过还原（氢化）后变成羟基，羟基能以C₁₀的甲基为定位而排列成顺式和反式两种。

类固醇激素一般是白色结晶或白色粉末，不溶于水，易溶于乙醚、乙醇、丙酮、氯仿等脂肪溶剂、氢氧化钠溶液及植物油中。各种激素的熔点不同，约在100～240℃范围内，有些激素在熔融时同时分解。.

2 激素的作用

激素是一种有机化合物，其生理效应很强。各种激素的作用都有一定的特异性。在体内某些特定的部位，起一定的生理作用。同时能协调机体内部各器官之间互相关系，促进或延缓代谢，调节酶的活性，并支配人的精神状态和健康状况。

1938年Dolds合成己烯雌酚后，已广泛地应用于化妆品中。经过各种实验，，其结果已被确认。1盎司（约28g）膏霜中，加10，000 IU（国际单位）卵泡激素和1mg己烯雌酚，在老化皮肤上连续使用6星期，发现在涂敷部位有表皮再生和水分含量增加现象。另外在患有退化性薄皮症的老年妇女皮肤上局部涂用卵泡激素3星期后，皮肤有增厚的趋势。通过对有效浓度、全身副作用与皮肤肌的深入研究，发现卵泡激素首先使皮肤恢复弹性减少皱纹；其次，当卵泡激素的外用量达1％以上时，能抑制雄激素，防止皮脂腺分泌。因此，卵泡激素可以制成治疗粉刺的外用药。

卵泡激素另一个作用是能生发。无论男性或女性，体毛都受雄激素支配，还与肾上腺系的17-甾酮类激素有关。雄激素过剩会大量分泌皮脂，易患脂溢性脱发症。曾对158例脱发者使用含有天然雌二醇及其衍生物雌二醇苯甲酸酯或人工合成品二乙基乙烯雌酚的1.5～3.O％的酸性生发水后，疗效84％。

孕烯醇酮对性腺没有影响，对皮肤则能促进表皮的生长。而且与性腺一样，在表皮细胞层增大和细胞核以尿原形质扩大的同时，会给细胞带来增殖。在3位（C₃）上的羟基经酯化或醚化而得到的衍生物，涂在皮肤上可减少皱纹。含0.1～0，5％孕烯醇酮膏霜，在土拨鼠身上进行皮肤外敷试验时，可观察到皮肤的弹性的嫩润性有明显改善。含0.5％醋酸孕烯醇酮膏霜对94岁老妇进行二次重复检验，经过3个月临床试验有明显的效果。

3 激素的生物活性

具有雄激素生物活性的物质，主要是睾酮、脱氢异雄酮、△⁴-雄烯二酮、雄酮等。睾酮是从男性睾丸组织分泌出来的，女性的雄激素是由肾上腺皮质产生的。在体内代谢过程中，睾丸酮被还原成雄酮、异雄酮和原胆烷醇酮。人工合成的甲基睾丸酮、丙酸睾丸素不存在于自然界内。各种雄性激素的活性不同，采用外给药法时，甲基睾酮与睾酮活性相等。如果口服，则甲基睾酮活性较外给药低2～4倍，较口服睾酮时活性大20倍。

雌激素是由卵巢的卵泡和黄体分泌的。主要是雌二醇、雌酮和雌三醇，后二者是前者的代谢产物。它们的活性比例为100:l0:3，其中雌二醇活性最强，在卵泡液中占全部活性的90％。人工合成的二苯乙烯衍生物，具有显著的雌激素生物活性，但不属于类固醇化合物。其中主要有己烯雌酚，口服时，其活性比天然雌激素大得多。

孕酮是由卵巢的黄体产生的，肾上腺皮质也能制造微量的孕酮。孕酮能促进子宫和乳腺的发育，帮助受精卵着床及胚胎正常发育。在临床上常用孕酮防止流产和子宫功能性出血。

4激素的测定

表 2-3-33 激素与硫酸的反应

激素的化学测定方法有经典的比色法，薄层色谱和气相色谱、高效液相色谱法。随着分析技术的提高和分析仪器的发展，高效液相色谱法越来越被广泛采用。

4.1 基于与硫酸的呈色反应的定性检验

类固醇激素化合物与硫酸的呈色反应，系经典鉴别激素的反应。如表2-3-33所示，利用此反应可以初步判断激素的存在及存在的种类。其方法如下：取约数毫克样品，加2m1硫酸，搅拌均匀。如样品含有激素将呈现特有的颜色或荧光。然后缓慢加水（10ml），观察其变化。

类固醇激素与硫酸呈色反应的机理，木村道也认为是质子化反应，形成正碳离子，然后进行HSO₄^-添加。

曾经有人用△^1.4-3-酮及△⁴-3-酮基类固醇进行比较实验，其结果表明：①凡具有△⁴-3-酮基的甾体激素酸化后均能立即呈现黄色；②具有△^1.4-3-酮基甾体激素酸化后1～3min呈现黄色反应；③不具有上述结构不呈色。

4.2 比色测定法

激素的比色测定法是基于激素与特定试剂（如对苯二酚、硫酸、异烟肼等）产生的特定呈色或荧光物质，根据其呈色／荧光的强度与已知标准进行比较而定量。如在“一”节中的雌激素的对苯二酚比色法。在表2-3-34列入了某些激素的比色测定的条件。激素的比色测定法，一般说特异性不高，受化妆品中其他成分的干扰较多，因此在进行显色和比色测定前，需将样品中激素预先提取、分离和纯化。

4.3 薄层色谱法

激素的薄层色谱法是一种简便、干扰少、特异性强的经济易于推广的方法。它利用层析法的强分离效能，可将样品溶液中各种激素和干扰物质一一分离，比较样品溶液各斑点、与标准的R

表2-3-34 激素比色测定的波长

4.4气相色谱法

近年来有气相色谱法测定激素的报导：将激素先甲基硅烷化，然后用2％OV-17的填充柱和备有氢火焰检测器的气相色谱仪分离测定。由于激素是高沸点、低挥发性物质，一般不适宜采用气相色谱法进行测定。

4.5 高效液相色谱法，

高效液相色谱法是目前应用最广泛的测定激素的方法。除本章二～五节中介绍的四种方法外，表2-3-35还列举了部分文献资料。虽然其中测定的样品不是化妆品，但也具有极大的参考价值，对样品处理方法稍加修改就可应用于化妆品分析。

表2-3-35 HPLC分析激素的实例

根据文献资料可以得到如下有关性激素分离、测定的信息：

（1）羟基的数目和位置是影响保留值的重要因素；（2）增加酮基明显增加在反相色谱中的极性，但在正相色谱中不甚明显；（3）正相和反相色谱的出峰顺序并不完全颠倒：（4）C-16和C-17位上的羟基对极性影响的顺序为： 17?＜17?＜16?＜?；（5）在正相色谱中6-酮雌二醇极性大于16-酮基雌二醇，而在反相色谱中则相反；（6）分离多羟基雌激素，反相优于正相色谱，而分离异构体则正相有时优于反相色谱。

从分离方法来看，主要有阴离子交换和反相HPLC两种。前者的分析柱填料常常为化学修饰的纤维素或硅胶季胶盐键合剂，雌激素结合物在其上的出峰顺序多为A环结合物先于对应的D环结合物，葡萄醛酸酯先于对应的硫酸酯。而激素母体的出峰顺序在纤维素柱上为雌三醇、雌酮和雌二醇；在硅胶季铵盐键合柱上则为雌三醇、雌二醇和雌酮，且D环葡萄醛酸醋先于对应的A环结合物。在反相HPLC中，A环结合物先于对应的D环结合物，葡萄醛酸酯先于对应的硫酸酯，而雌激素的出峰顺序为雌三醇、雌二醇和雌酮。在流动相中加入溴化四乙胺等配对离子物质可以缩短分离时间，提高分离效果。

雌激素A环为苯环，在254nm和280nm均有紫外吸收，因此在HPLC检测中广为应用。但是，当A环酚羟基游离时，荧光和电化学检测的灵敏更高，特别是检测儿茶酚性雌激素及其结合物。通过分析柱后串联B-葡萄醛酸酯酶反应柱，使A环结合物游离，电化学和荧光检测被成功地用于雌激素A环结合物的分析。

孕激素是C-21的一类化合物。由于反相HPLC法更能获得尖锐和对称的峰形，而且生物样品中的极性杂质易在溶剂前沿流出，因此广为应用。但是，四个不同结构的二酮，4-和5-孕烯二酮及5?-和5?-孕烷二酮在正相条件下却能更好地分离，反相HPLC测定人体组织中孕激素、雄激素和各种皮质激素的含量能直接为临床诊断卵巢肿瘤或肾上腺癌提供科学依据，因此研究颇多。

雄激素在3位、5位和17位上存在立体异构体；在硅胶柱上，用二氯甲烷-乙腈-异丙醇（179＋20＋l）为流动相时，它们的出峰顺序为3?,5?＞3?，△5>3?，5?>3?,5?，而用甲醇-水为流动相和反相柱时，出峰顺序为：去氢表甾酮,表雄笛甾和雄甾酮。此时带横键羟基的雄激素比在对应位置上带竖键羟基的雄激素先出峰。△⁴-3-酮的睾丸酮等在254nm有强紫外吸收，低至30ng的睾丸酮可被检测。而17-酮的雄激素虽然在280nm比在254nm有更强的紫外吸收，但其灵敏度甚低，仅为△⁴-3酮雄激素的1／50。这样低的检测灵敏度有时不能满足于雄激素的测定。因此通常制备成苯甲酸酯、对-硝基苯甲酸酯或2，4-二硝基苯腙等衍生物进行紫外或电化学检测。

二、

三、 雌二醇和雌酮----高效液相色谱法

1 应用范围

本法适用于含有雌性激素的各类化妆品。测定范围0～75?g/ml，最低检出浓度，雌二醇为0.258µg/g,雌酮为0.234µg/g。

2 原理

氢氧化钠与化妆品中的油脂进行皂化反应，用石油醚除去剩余的油脂和蜡等干扰物质。雌二醇和雌酮游离溶解在氢氧化钠溶液中，被二氯甲烷萃取，通过高效液相色谱进一步分离并定量测定。

3 试剂

3.1 雌二醇、雌酮混合标准储备溶液：精确称取雌二醇和雌酮各10.000mg,用无水乙醇溶解并稀释至100ml,1ml含雌二醇、雌酮各100.0?g。

3.2 溶剂:乙腈、二氯甲烷、乙酸乙酯、已烷、石油醚均为分析纯，无水乙醇为优级纯。

3.3 5%氢氧化钠溶液。

4 仪器

4.1 高效液相色谱仪：美国Waters分司810系列（HPLC）具510型 泵，UOK进样器和490E紫外-可见光检测器。

4.2 PT系列处理小柱（硅胶柱）：津杨滤材厂（河北省）。

5 分析步骤

5.1 样品预处理

称取1g样品于小烧杯中,加10ml 5%氢氧化钠溶液,充分搅拌溶解后,倾入分液漏斗,用5ml 5%氢氧化钠溶液洗烧杯一次,倾入分液漏斗。

加20ml石油醚^（1）萃取1min，分层后将醚层倾入另一分液漏斗，反复萃取三次，合并醚层并加5ml 5%氢氧化钠溶液洗醚层一次，弃醚层。

合并氢氧化钠层，加10ml二氯甲烷萃取1min，分层后放出二氯甲烷于蒸发皿中，萃取三次，合并二氯甲烷层并蒸发近干，残渣用2ml无水乙醇溶解，必要时离心分离，此溶液为样品A。

氢氧化钠层用盐酸凋pH值到5以下^（2），加10ml二氯甲烷萃取1min分层后，放出二氯甲烷于蒸发皿中，反复萃取三次，弃氢氧化钠层，合并二氯甲烷，蒸干。残渣用2ml无水乙醇溶解，离心分离，上清液为样品B。合并A、B液，浓缩至2ml作为待测溶液。

当样品中干扰物质含量较高时，用硅胶色谱预处理小柱进行净化。将待测溶液注入硅胶柱，吸附后先用10～20ml已烷+乙酸乙酯（95+5）将极性较弱的干扰物质洗脱下来，然后用15ml已烷+乙酸乙酯（50+50），将雌酮、雌二醇洗脱下来，洗脱率为75～100%。

5.2色谱条件

色谱柱：HP ODS200mm×4.6mm。

流动相：乙腈+水（36+64）。

流速：1.6m1／min。

检测器： Waters 490E紫外可见光检测器。

检测波长： 280nm。

保留时间：雌二醇9.01min，雌酮14.07min。

5.3 定性

吸取雌酮、雌二醇标准溶液20µl注入HPLC，记录保留时间。吸取待测溶液20?l注入HPLC，记录保留时间，和标准保留时间比较进行定性。

5.4 定量

5.4.1 标准曲线

取1.0、2.0、4.0、5.0ml雌酮、雌二醇标准贮备液于50ml容量瓶中，用无水乙醇稀释至刻度，分别取20µl注入色谱仪，绘制峰高一浓度标准曲线。

5.4.2 测定

取待测溶液20?l注入色谱仪，记录峰高，由标准曲线求出样品中雌酮、雌二醇的浓度A（µg/ml）。

6 计算

c=A×V/m

式中：c－一雌酮、雌二醇的含量，µg/g；

A一一由标准曲线查出的样品中雌酮、雌二醇的浓度，µg/m1；

V－一样品溶液总体积，m1；

M－一样品质量，g。

7 精密度和准确度

单个实验室测定膏霜类、生发类和丰乳类样品14件，加入不同浓度的雌二醇和雌酮标准溶液，充分混合后，按本法测定，回收率为80～100％。

当雌二醇和雌酯浓度各为10µg／g时，雌二醇标准偏差为0.43，雌酮为0.36，相对标准偏差分别为6.1％和5.2％（n=7）。

注解：

（1）如果石油醚乳化，加少量丙酮，如果乳化严重，必须重称样品，加氯仿并加热溶解，过滤，挥发除去氯仿，残渣用2ml乙醇溶解，加20ml 5%氢氧化钠溶液转入分液漏斗，以下步骤同前。

（2）雌二醇具有羟基，呈弱酸性，当pH大于11的碱性溶液中，二氯甲烷萃取雌二醇回收率为40%以下，雌酮80%，因此在碱性条件下萃取后，将溶液pH调至酸性（pH13～5）再萃取雌二醇，二次萃取总回性率为80～100%