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反相高效液相色谱法
防晒化妆品的组分含有紫外线吸收剂。常用的紫外线吸收剂为水杨酸、对氨基苯甲酸、肉桂酸、二苯甲酮等的衍生物。此外，为了完全防止紫外线，防晒化妆品中还加有能使紫外线散乱起到遮蔽作用的无机覆盖剂，如氧化锌、氧化钛、滑石粉、高岭土等，我国化妆品卫生标准GB
7916一87对紫外线吸收剂的使用量做了限制。
本法使用高效液相色谱，一次进样同时测定2，4-二羟基二苯甲酮等14种紫外吸收剂，分离效果好。本法简单、快速、灵敏、实用。
1 应用范围
本法适用于防晒化妆品中紫外线吸收剂的检测，可检测14种紫外线吸收剂，其最低检测量见表2-3-27。
表2-3-27紫外吸收剂及化妆品卫生标准（GB 9716-87）中规定的化妆品中最大允许浓度
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序号
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代号
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物质名称
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英文名称
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本法检出限(?g/g)
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最大允许浓度(%)
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供应商
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保留时间(min)
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?m
(nm)
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5-11
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SALA9
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水杨酸高()(此字由艹和孟组成)脂
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Homomenthyl salicylate
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25
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10
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Quest In-ternational(NL)
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43.22
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250.61
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5-20
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SALA9
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水杨酸-4-异丙基苄酯
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4-Isopropylbenzyl salicylate
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4
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Vebvy(Ⅰ)
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39.59
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240.75
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5-3
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PABA8
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对-二甲按基苯甲酸-2-乙酸已酯
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2-ehylhexyl 4-dime-thylaminobenzoate
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2.5
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8
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Van Dyk (NL)
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42.35
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304.20
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BENZ1
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2,4-二羟基二苯甲酮
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2,4-Dithydroxyben-zophenone
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5.0
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-
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Sigma(Ⅰ)
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27.05
|
284.75
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BENZ2
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2,2′-二羟基-4-甲氧基二苯甲酮
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2,2′-Dihydroxy-4-methoxyben-zophenone
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7.5
|
-
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Saipo(Ⅰ)
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29.85
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284.39
|
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BENZ3
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2,2′-二羟基-4,4′-二甲氧基二苯甲酮-5-磺酸(钠盐)
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2,2′-Dehydroxy-4,4′-dimethoxyben-zophenone-5-sulfon-ic
acid(sodium salt)
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10.0
|
-
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Saipo(Ⅰ)
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3.27
|
263.06
|
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BENZ4
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2,2′,4,4′-甲羟基二苯甲酮
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2,2′,4,4′-Tetrahy-droxybenzophenone
|
5
|
-
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Saipo(Ⅰ)
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17.05
|
292.07
|
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5-32
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BENZ5
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2-羟基-4-甲氧基二苯甲酮
|
2-Hydroxy-4-methoxyeben-zophenon
|
5
|
10
|
Sigma(Ⅰ)
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33.84
|
284.00
|
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5-33
|
BENZ6
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2-羟基-4-甲氧基二苯甲酮-5-磺酸(钠盐)
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2-Hydroxy-4-methoxy-benzophe-none-5-sulfonic
acid (sodium salt)
|
7.5
|
5(酸)
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Sigma(Ⅰ)
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9.91
|
266.82
|
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5-17
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CAMP4
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3-(4-甲基亚苄基茨烷-2-酮)
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3-(4-Methylbenzy-lidene)-bornan-2-one
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2.5
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6
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Merck(D)
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38.61
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294.02
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5-27
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SSCR1
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2-苯基苯咪唑-5-磺酸
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2-Phenylbenz-imidazole-5-sulphnic acid
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2.5
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8(酸)
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Saipo(Ⅰ)
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6.89
|
278.29
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5-14
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CINA7
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对-甲氧基肉桂酸二乙酸铵
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Diethanolammonium 4-methoxycinnamate
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2.5
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3(酸)
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Saipo(Ⅰ)
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18.49
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292.24
|
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5-18
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CINA10
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对-甲氧基肉桂酸异戊酯
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Isoamyl 4-methoxycinnamate
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1.3
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10
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Haarman & Reimer (NL)
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37.73
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294.94
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5-5
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CINA11
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对-甲氧基肉酸-2-乙酸已酯
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2-Ethylhexyl 4-methoxy-cinnamate
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10
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Givaudan (CH)
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42.29
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292.78
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* 此序号为化妆品卫生标准(GB 7916-87)中表5的序号,5-11即表5中的序号11。
2 原理
化妆品中各种紫外吸收化合物由于其结构上的差异可被反相高效液相色谱分离。根据其保留时间及其紫外可见吸收光谱进行定性；峰面积进行定量。
3 试剂
3.1 甲醇:色谱级。
3.1 乙腈:色谱级。
3.3 紫外吸收剂贮备液:取表2-3-27紫外线吸收化合物各0.1000g,用甲醇溶解并定容至100.0ml。浓度为1.00mg/ml。
紫外吸收剂标准溶液：取上述紫外吸收贮备液10.0ml,用甲醇定容至100ml,浓度为0.10mg/ml。
3.4 高氯酸:分析纯。
3.5 高氯酸钠:分析纯。
3.6 硫酸:分析纯。
3.7 水、去离子水及二次重蒸水。
所有溶剂和溶液在进行HPLC分析前都经0.45?m的微孔滤膜过滤及真空脱气。
4 仪器
4.1 高效液相色谱仪：Varian 5000型（Z?g，Switzerland）。
4.2 检测器：Varian polychrom 9060型二极管珍列阵检测器。
4.3 积分仪：Varian 4290型。
4.4 微量进样器：10?l。
5 分析步骤（1）
5.1 称取1g防晒化妆品于离心管中，加0.25ml
2mol/L硫酸和10ml甲醇,30℃恒温超声水浴30min，然后以900r/min离心10min，提取上清液；残留物按上述方法重新萃取一次，合并二次萃取液，用甲醇定容至25ml。
5.2色谱条件
5.2.1色谱柱：Lichrosorb RP-18 柱（250mm×4.6mm
id.，10?m，Merck，Darmstadt，F.R.G.）。
5.2.2 流动相
流动相A： 10-3mol／L的高氯酸和5×10-2mol／L高氯酸钠的乙腈-水溶液（5+95，V／V）；
流动相B：1×10-3mo1／L高氯酸和5×10-2mo1／L高氯酸钠的乙腈-水溶液[35＋65，V／V］。
流动相C：1×10-3mo1／L的高氯酸和5×10-2mo1／L高氯酸钠的乙腈-水溶液（80＋20，V／V）。
起始为流动相A，在20min内线性梯度变换到流动相B：保持流动相B
5min，然后在40min内梯度变换到流动相C。
5.2.3 流速：2.5ml/min。
5.2.4 柱温：30℃。
5.2.5 进样体积：10?l。
5.2.6 检测波长：3l1 nm。
5.2.7 检测器灵敏度：0.32a.u.f.s.。
5.2.8 纸速：0.5cm／min。
5.3 测定
5.3.1 定性
取10?l样品处理液（5.l），注入高效液相色谱仪。根据其保留时间（参照表2-3-27）及紫外可见吸收光谱定性。
5.3.2 定量
5.3.2.1 标准曲线
移取0、0.50、1.00、2.00、4.00、6.00、8.00、10.0ml紫外吸收剂标准液于10ml具塞刻度管中，用甲醇稀释至刻度。取10?l进行高效液相色谱分析，记录各峰面积，用峰面积与对应的紫外吸收剂浓度作图获得标准曲线。
5.3.2.2 取5.1制备的样品处理液，进行高效液相色谱分析，记录其各峰面积。在标准曲线上查得相应的紫外吸收剂浓度。
6 计算
按下式计算防晒吸收剂含量：
c=A×25/（m×10000）
式中：
c一一样品中紫外吸收剂的浓度，%；
A－一从标准曲线上查得的紫外吸收剂浓度，µg/m1；
m－一样品质量，g。
7 方法的准确度、精密度
样品加标加回收率为97～100％，平均变异系数不大于2％（n=5）。
注解：
（1）由于PABA 8和CINA II在所用色谱条件下不能分离（如图1），在进行分析之前确定样品中是否同时存在这两种物质是必要的。可用薄层层析对其进行快速扫描。
（2）若样品中PABA 8及CINA 11共存，为了分离这两种防晒剂，样品经10ml甲醇离心后，减压蒸馏此甲醇溶液，残渣用5ml
2mo1／L硫酸萃取两次，合并上层酸萃取液。此萃取液含有PABA
8（溶液A）；萃取残渣用10ml甲醇溶解，该液（溶液B）含有CINA
11。溶液A、溶液B分别进行HPLC分析。此时标准溶液也需配两组：标准溶液A，含有BENZ
4， BENZ 8，SSCR 1， PABA 8，用2mo1／L的硫酸作溶剂；标准溶液B，含有其余的10种紫外吸收化合物，用甲醇作溶剂。图2 为标准溶液A和标准溶液B的色谱图。
（3）保留时间在实验条件下重现性良好，平均变异系数小于3％。
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