|
甲醛又称蚁醛，为无色液体，有刺激性气味，分子量为30.03。甲醛易溶于水、醇和醚，商品甲醛水溶液为了防止聚合作用往往加入0～15％的甲醇。其35％～40％的水溶液称为。福尔马林。
甲醛对皮肤、眼、呼吸器官的粘膜有刺激作用。低浓度的甲醛可引起过敏性接触皮炎。我国化妆品卫生标准规定甲醛为限用物质，游离甲醛的浓度不得大于0.2％(1)。
化妆品中甲醛的定性方法有薄层色谱法、变色酸法；定量法有比色法、气相色谱法和高效液相色谱法，在比色法中又有乙酰丙酮法、荧光法4-氨基-3-联氨-5-疏基-1，2，4-三氮杂茂（AHMT）等方法。薄层色谱法手续较繁，但其特异性强，可以作为确认方法。变色酸法较简便，但易受酚和其它醛类物质干扰，使测定结果偏低。乙酞丙酮法灵敏度高，干扰因素少，呈色稳定。荧光法灵敏度高。但易受其它荧光物质的干扰。
AHMT法有方法简便、灵敏度高，干扰物质少的优点。气相色谱法和液相色谱法直接测定时灵敏度不高，但通过衍生后，能提高灵敏度，手续也不复杂，在国外被普遍采用。
（一）薄层色谱定性法
1 应用范围
本方法适用于化妆品中甲醛的测定。
2 原理
样品中甲醛经浸提、分离、衍生、浓缩手续后，用薄层展开。然后根据其在薄层上显示的荧光斑点的Rf值与标准进行比较定性。
3 试剂
3.1甲醛标准贮备溶液：准确称取甲醛（优级）约1g加纯水1000ml作为标准贮备溶液。用碘量法标定贮备溶液中甲醛的浓度(2)。
0.05mo1／L碘溶液lml=1.5013mgHCHO。
3.2甲醛标准溶液：取适量的标准贮备溶液用水稀释成所需浓度的标准溶液（1～4?g／m1），此溶液临用时配制。
3.3 2，4-二硝基苯姘（DNPH）溶液：取DNPH（优级）0.5g，加温溶解于85ml
HCl（l＋2）中，冷后，加水至500ml，用20ml四氯化碳洗涤水层一次，临用时配制。
3.4 硅胶：添加有荧光剂的薄层色谱硅胶。
3.5 薄层板：取（10×20cm或20×2Ocm）的薄层色谱玻璃板，涂布250?m厚的硅胶于薄层色谱玻璃板上，在110℃干燥30min后避湿保存。
3.6 展开剂：正己烷+苯+三乙胺（6＋4＋0.5）。
4 仪器
4.1薄层色谱用装置。
4.2紫外线灯：可发射365nm左右的紫外线。
5分析步骤
5.1样品的预处理
取样品lg于具塞离心管中，加25％的Na2SO4（3）溶液20ml，振摇，加水至总量40ml。密塞，在40℃水浴中不断振摇并恒温1小时（4）。用水使之冷却后，以3500r／min转速离心10min，用No2玻璃砂芯漏斗过滤，滤液作为待测溶液。
5.2 测定
取样品待测溶液和甲醛标准溶液各5ml，分别于100ml分液漏斗中，加5ml
HCl，10ml DNPH，准确加入10ml四氯化碳，充分振摇10min，待分层后，分别取四氯化碳5～10?1在距薄层板底端3cm，两样间隔lcm处点样，用展开溶剂按上升法展开约10cm。取出风干后，在紫外线照射下，比较样品斑点和标准溶液斑点的Rf值进行定性（5）
注解：
（1）很早就知道甲醛能引起刺激性皮炎，即使是低浓度的甲醛也能引起过敏性接触皮炎。甲醛作为防腐杀菌剂，用于化妆品及洗洁剂等的防腐浓度是0.005％。但在日本规定化妆品内不允许添加，1986年3月12日日本药审节第100号通知中规定甲醛为禁用品。
1974年9月26日厚生省令第34号指定甲醛是有害物质，在假睫毛使用的粘接剂中允许容量为75?g／g以下，此甲醛的允许量是根据人的粘贴试验的结果。成人最大的无作用量是750?g／g，取其十分之一为安全度。我国化妆品卫生标准规定化妆品中游离甲醛的最大允许浓度为0.2％。
（2）称取甲醛lg溶于5ml水中，用水稀释至总量100ml。取10.0ml加入0.05mol/LI2溶液50.0ml，lmol／L KOH溶液20ml，放置15min后加10％H2S04 15ml，用0.1000mol/L Na2S2O3溶液滴定，在终点附近加入淀粉指示剂。标定结果计算如下。
原液的浓度：
甲醛（mg／ml）=15.013×(V0一V）F
式中：
V－一本试验的0.1000mol/L Na2S2O3液消耗量（ml）；
V0一－空白试验的0.1000mol/L，Na2S203液消耗量（ml）；
F一一0.1O00mo1／L Na2S2O3；液的校正系数。
准确塞取含40mg的甲醛至100ml容量瓶中，加水至总量100ml，此溶液的浓度为400?g／m1。此溶液进一步稀释至4?g／m1。虽然原则上此标准溶液及标准贮备溶液应临用时现配，也可将已标定的甲醛贮于冰箱中，用时直接按标准溶液配制。如果超过两周应重新标定。
（3）25％的Na2SO4。溶液是接近饱和的浓度，可能会有少量结晶析出。雪花膏等在水中难以分散的样品，需振摇约15min，而洗发剂等容易起泡的样品要轻轻混合，不要剧烈振摇，立即加水成40ml。
在不同样品中添加Na2SO4的浓溶液，以分离悬浊物，但其滤液中有时仍含有不同程度悬浮物，在进行乙酞丙酮法测定时，如果以水为对照液则使吸光度增大，造成误差。将样品溶液和不加乙酞丙酮的醋酸按溶液混合，按显色条件进行处理和比色，可避免这种干扰。
（4）甲醛测定时，作为样品的前处理，以往多用磷酸酸性水蒸汽蒸馏法，但妆品采用该方法时,其成分中含有的氧化乙烯链的表面活性剂等易受热分解,而产生微量甲醛。因此本试验规定在40℃处理样品。
（5）此方法是使甲醛生成2，4-二硝基苯肼衍生物。在加入荧光剂的薄层色谱板上用紫外灯进行确认。本法甲醛的检出灵敏度比常用的变色酸法、乙酞丙酮法低，但可和其它的醛酮分离，其优点是可以确认甲醛。本法可确1g样品中400?g以上的甲醛，化妆品以防腐目的而力队的甲醛，一般在0.05％（500?g／g）以上，适合本法测定范围。薄层色谱的检出下限是0.025?g（涂布5?gHCHO/l0ml
CCl4），因此如仅以定性为目的，通过增加样品量，减少溶剂量可检出更微量的甲醛，见图2一3一32
Rf RFor-
1. 甲醛 0.24
1.00
2. 乙醛 0.30
1.25
3. 丙烯醛 0.39 1.63
4. 正丁醛 0.42 1.75
5. 异丁醛 0.45 1.88
6. 苯甲醛 0.35 1.46
(二) 变色酸定性法
1 应用范围
同薄层色谱法
2 原理
甲醛在硫酸介质中与变色酸作用，生成紫红色化合物，根据溶液颜色进行定性。
3 试剂
3.1 甲醛标准贮备溶液：与薄层色谱定性法同。
3.2 甲醛标准溶液：与薄层色谱定性法同。
3.3 变色酸溶液：取变色酸0.5g溶于72％硫酸（于100ml水中加150ml硫酸）100m1中备用。
4 分析步骤
4.1 样品预处理：与薄层色谱定性法同。
取待测溶液1m1，加变色酸溶液5m1置于沸水中加热10min，如有甲醛存在溶液即呈紫红色(1)。
注解：
（1）变色酸法易受酚和其它醛类的干扰，若为阳性结果可用薄层色谱法进行确证，或者用其它方法进一步做定量试验。
（三）乙酞丙酮定量法
1应用范围
同薄层色谱法。
2原理
甲醛与乙酰丙酮和氨作用生成黄色3，5.二乙酰基。1，4-氢卢剔啶，根据颜色的深浅比色测定甲醛含量。
3试剂
3.1甲醛标准贮备溶液：与（一）薄层色谱定性法同。
3.2甲醛标准溶液：与（一）薄层色谱定性法同。
3.3乙酰丙酮溶液：取150g醋酸铵溶于纯水中，加3ml醋酸和2ml乙酷丙酮，再加水至1000m1。
3.4 醋酸铵溶液：称取醋酸按150g溶于纯水中，加3ml醋酸，再加水至1000ml。
4 分析步骤
4.1样品预处理：与（一）薄层色谱定性法同。
4.2 测定
取待测溶液5ml，加乙酰丙酮溶液5m1，摇匀后在4O℃水浴中加温30min，置室温下放置30min(1)，加醋酸铵溶液5ml。另取待测溶液5ml同样加热、冷却，加醋酸铵溶液5ml作为校正液(2)，以10mm比色杯于412～4l5nm处测定吸光度，待测溶液和校正液之差值作为A；另取标准溶液和水各5ml，分别按待测溶液进行操作，以水为参比测定吸光度作为As和A。
5计算
c=K×(A-A0)/(As-A0)×40×1/m×1/1000
式中：
c－一样品中甲醛的含量，%；
K一－1ml标准溶液中甲醛量，?g；
A――待测液与校正液吸光度的差值；
Ａs一一标准溶液吸光度值；
Ａ0－一以水为参比液测定的吸光度值；
m一－样品质量，g。
注解：
（1）乙酞丙酮法的显色条件： 40℃加热30min后，于室温下放冷30min（家庭用品标准）；
40℃加温30min后5min水冷（卫生试验法衣服处理剂实验法）和沸腾水浴中加热10min放冷（一般实验法）等。化妆品中某些原料在发色温度高时增加发色度。例如，环氧乙烷附加物中的表面活性剂等就有这类现象。因此检验化妆品中游离甲醛时，必须在同样的温度条件下处理的样品液为校正液。此外，条件实验表明，本发色温度和时间下发色强度基本是稳定的。
（2）由于有的待测溶液或显色后的溶液呈现轻度混浊，为了消除浊度对吸光度的干扰，在实验溶液中加入不含乙酞丙酮的醋酸铵缓冲液，作为校正液。基本上可消除干扰。
（四） 4-氨基-3-联氨-5-疏基-1，2，4-三氮杂茂（简称AHMT）法定量
1 应用范围
同薄层色谱法
2 原理
化妆品中甲醛与4-氨基-3-联氨-5-巯基-1，2，4-三氮杂茂在碱性条件下缩合，然后经高碘酸钾氧化成个巯基-5-三氮杂茂[4，3，b]四氮杂苯的紫红色化合物，其色泽深浅与甲醛含量成正比。
3试剂
3.1 AHMT溶液：称取4-氨基-3-联氨-5-疏基-1，2，4-三氮杂茂0.5g溶于100ml
0.5mo1／L盐酸中。此溶液置于棕色瓶中保存。
3.2 高碘酸钾溶液：称取0.75gKIO4，加100ml0.2mo1／L氢氧化钾置于水浴上加热溶解。
3.3 5mol／L Na0H溶液，AR。
3.4 甲醛标准贮备溶液：与（一）薄层色谱定性法同。
3.5甲醛标准溶液：与（一）薄层色谱定性法同。
4分析步骤
4.1样品预处理
与（一）薄层色谱定性法同。
4.2 测定
分别取2.0ml待测溶液置于具塞比色管中，加入2ml
5mo1／L的NaOH溶液，2ml AHMT溶液，轻轻颠倒混匀三次后(1)，于室温下放置20min。然后加入2m1高碘酸钾溶液，轻轻振摇（避免激烈摇动，以免产生气泡）混匀(2)，于550nm处测定待测溶液的吸光度。根据标准曲线求出待测溶液中甲醛的浓度。
4.3标准曲线的绘制：分别取甲醛标准液0.50、1.00，1.50、2.00ml置于比色管中，加水补足至2m1。以下按样品溶液分析方法操作。根据各标准溶液中甲醛的浓度与吸光度的对应关系绘制标准曲线。
注解：
（1）在加AHMT溶液后应轻轻颠倒混匀，否则会影响下一步缩合反应，使结果产生误差。
（2）若样品溶液中含有大量的碱土金属，样品在显色时可能产生混浊，加少量EDTA即可消除影响。
（五）气相色谱法[1]
1 适用范围
本方法适用于化妆品中游离甲醛的测定。
2 原理
样品中的游离甲醛和2，4-二硝基苯肼衍生化后，经甲苯萃取，用气相色谱进行定性、定量。
3试剂
3.1甲醛标准溶液：同（一）薄层色谱定性法。
3.2 2，4.二硝基苯肼磷酸溶液（DNPH）：称取2，4－二硝基苯肼0.2g加入2mol/L磷酸溶液1000ml。水浴上加热溶解，过滤备用。
3.3纯水：离子交换水中加少量高锰酸钾用全玻璃蒸馏器蒸馏。
3.4甲苯：在本法测定条件下应无干扰峰。
4 仪器
4.1气相色谱仪：具电子捕获检测器。
4.2 100ml分液漏斗。
5 分析步骤
5.1样品前处理
同（一）薄层色谱法。。
5.2色谱条件
色谱柱：玻璃柱lm×3mm，填充涂有2％OV-22的Chromosorb
W AW DMCS60 ～80目。
柱温：190℃。
进样口温度240℃
检测器：电子捕获检测器Ni63，温度：240℃。
载气；氮气；流速： 60ml／min。
5.3测定
5.3.1 定性
取待测溶液10.0ml于100ml分液漏斗中,加20mlDNPH溶液,10ml甲苯,振摇5min.静置分层。分取甲苯层并稀释至20ml。加少量无水流酸钠脱水。取5?1注入色谱仪，与标准保留时间比较定性。
5.3.2 定量
5.3.2.1 标准曲线:取甲醛标准溶液10.0ml于100ml分液漏斗中,以下同定性(5.3.1)项下操作。取衍生后的甲醛标准液用苯稀释，配制成每毫升含0～5µg的标准系列，各取5.0µl注入气相色谱仪,记录高峰高,绘制峰高-浓度标准曲线。
5.3.2.2 取待测样品5.0?l注入气相色谱仪,记录峰高,由标准曲线查出相应甲醛浓度Aµg/ml。计算样品甲醛含量。
6 计算
c=A×V/m×1/10000
式中:
c－一甲醛百分含量，％；
A――由标准曲线查出的样品溶液中甲醛含量，µg/ml；
V－一待测溶液稀释的总体积，ml；
W一一样品值量，g。
（六）高效液相色谱法
测定游离甲醛的常用方法是利用甲醛与乙酰丙酮在过时铵盐存在下缩合生成荧光性的3，5-二乙酰基-1，4-二氢卢剔啶，荧光光计法测定。尽管此法灵敏，但它不适合于含有甲醛释放剂化妆品中游离甲醛的测定，因为在体质过程中甲醛释放剂出额外的甲醛。本法采用标准加入法，利用柱前甲醛与2，4-二硝基苯肼（2，4-DNPH）生成衍生物，反相高效液相色谱分离，紫外检测器检测。方法愉速、可靠，无需复杂的样品前处理，适用范围广。
1应用范围
本法适用于乳剂、清洁剂、洗发剂、消毒剂及牙膏中游离甲醛的测定，其最低检出限为2ppm。
2 原理
甲醛与2，4.二硝基苯肼反应生成2，4.二硝基苯肼的甲醛衍生物(1)。经高效液相色谱
分离，紫外检测器检测，以标准品的保留时间定性，峰面积定量，测得甲醛含量。
3试剂
3.1 0.1％2,4-二硝基苯肼：称取0.25g 2，4-二硝基苯肼（2，4-dinitrophenylhydrazine，2，4-DNPH）溶于100ml
32％盐酸中，加热至2，4-DNPH完全溶解，用去离子水定容至250ml。
3.2 甲醛标准溶液：40％甲醛溶液（碘量法测其含量）用9:1四氢呋喃（THF）-水稀释成浓度为0.100mg／ml甲醛溶液。此溶液临用时配制后，短期内可存于冰箱中。
3.3 四氢呋喃：分析纯。
3.4 乙睛：优级纯。
3.5 氢氧化钠：优级纯。
3.6 0.1mol／L磷酸盐缓冲液（pH 6.8）。
4 仪器
4.1 高效液相色谱仪： Perkin一Elmer 4l0型。
4.2 3700型数据工作站。
4.3 涡流混合器（Vortex Mixer）。
5 分析步骤
5.1 样品预处理
精确称取约1g待分析化妆品(2)于具塞试管中，用9:1四氢呋喃-水稀至10.0ml，在涡流混合器充分搅拌至样品和溶剂分散均匀；静置，上清液备用。
5.2 标准曲线
各取1.0ml样品备用液（5.1）于6只具塞试管，分别加入0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0ml甲醛标准溶液（3.2），用9＋1四氢呋喃+水稀释至5.0ml。在涡流混合器搅拌均匀。
5.3衍生化(3)
从5.2各管中分别取1.0ml加有样品的标准溶液于6只具塞试管中，各加入0.4ml
0.1％2，4-DNPH溶液；室温下用涡流混合器搅拌2min；静置后，加入0.4ml的0.1mo1／L磷酸盐缓冲液（pH
6.8）和0.7ml的1mo1／L氢氧化钠溶液，混合均匀。
5.4 色谱条件
色谱柱:Lichromsorb RP-8(10?m,250mm×4mm id)；
流动相：乙腈+水（1+1）；
流速：1ml/min；
柱温：室温；
检测：紫外检测器，检测波长345nm。
5.5 测定
各取6?l衍生化后的样品加标溶液（5.3），进行高效液相色谱分析（4）。记录其各峰面积，以保留时间定性（5），见图2-3-33。
6计算
以标准溶液浓度为横座标、峰面积为纵座标作图。绘制校正曲线并外推，延长线在横轴上截距的绝对值为浓度（C0）。
c=（C0）×2.5×5×10/(m×1000) ×100%
式中：
c――样品中甲醛量，％；
C0――校正曲线外推至横抽上的截距所示浓度的绝对值,?g;
M－一样品质量，g。
7 方法的准确度、精密度
用峰面积定量，甲醛浓度在2～40?g/m1范围内，平均变异系数小于1.5％。5种样品加标回收率在94～99％之间，相对标准偏差小于3.8％。
注解：
（1）在酸性条件下，2，4-二硝基苯肼作为碳基化试剂已被广泛应用。室温下此反应定量完全，与甲醛产生具紫外吸收的可被检测的衍生物。
（2）若样品中含有Dowicil 200[cis-1-（chloroallyl）-3，5，7-triaza-1-azoniaadamantanechloride]甲醛释放剂，不能用此法测其甲醛含量。因Dowicil
200在酸性溶液中极不稳定，分解释放出甲醛。因此测定含有Dowicil
200化妆品中的甲醛时，此法需加以修改。在衍生化前，样品溶液经过SCX阳离子交换柱，Dowicil
200完全被SCX阳离子交换树脂保留，再进行衍生化、HPLC分离测定即可①。
（3）衍生化反应时，3min内衍生物浓度即可达到最大，以后浓度逐渐降低，这是由于衍生物在酸性溶液中不稳定所致。用磷酸盐缓冲液及lmol/L氢氧化钠将溶液调至中性，衍生物在60min内保持稳定。
（4）在所用色谱条件下，不存在其它碳基化合物与2，4-DNPH反应产生干扰。2.4-DNPH及甲醛-2，4－DNPH衍生物的容量因子分别为1.67、2.35。
（5）色谱峰的定性，可采用停止流动相流动的情况下测其吸收峰的吸收光谱或测双波长（345nm、254nm）吸光度的比值。
|
