5.5 皮肤变态反应试验

5.5.1试验方法的原则

5.5.1.1由于接触致敏的发病过程包括致敏（诱导）和激发两个阶段，动物在第一次接触受试物后至少1周，再次给予激发接触。通过激发接触能否引起皮肤反应确定有无致敏作用。

5.5.1.2实验首选动物为白色豚鼠，每组动物数10～25只。

5.5.1.3受试物剂量（浓度）：致敏（诱导）浓度允许引起皮肤轻度刺激反应（即最高耐受浓度）。激发浓度一般应低于致敏浓度，不得引起原发刺激性皮肤炎症反应。

5.5.1.4为避免出现假阳性或假阴性结果，试验中除要求使用的试剂、绷带、胶布均无刺激性外，并设立阳性或阴性对照组。

5.5.1.5为提高皮肤反应的阳性率（增加敏感性），通常采用福氏完全佐剂（FCA），而不影响实验的评价。注：福氏完全佐剂（FCA）的制备：轻质石蜡油 50ml羊毛脂（或吐温80）          25ml结核杆菌（灭活）           62mg生理盐水                    25ml制成油包水乳化剂后，经高压消毒备用。

5.5.2豚鼠最大值试验（皮内和涂皮结合法，简称GPMT）

5.5.2.1试验前24h在豚鼠颈背脊柱两侧4cm×6cm范围内剪毛或脱毛。注：脱毛剂配方：可溶性淀粉                 6份滑石粉                     6份硫化钡                     6份颗粒状阳离子表面活性剂   27份用水调成糊状涂在脱毛部位，保留4min左右，用水冲洗残留脱毛剂。

5.5.2.2从头部向尾部成对地做三次皮内注射。①注射 0.1mlFCA；②注射0.1ml受试物；③注射0.1ml受试物与FCA的等量混合物。如图1所示，各点间距1.5cm。

5.5.2.3注射后第8天，用2cm×4cm滤纸涂以用适当赋形剂（花生油、凡士林、羊毛脂等）配制的受试物，将其贴敷在上背部的注射部位，持续封闭固定48h，作为第二次致敏。为加强致敏作用，对无皮肤刺激作用的化学物质，可在第二次致敏前24h，在注射部位涂抹10％十二烷基硫酸钠（SLS）。对照组仅用溶剂或赋形剂注射或涂抹。

5.5.2.4激发接触，即在末次致敏后14～28天，分别用2cm× 2cm的滤纸涂以受试物，再次贴敷在上背部两侧的去毛区，持续封闭和固定24h。对照动物作同样处理。

5.5.2.5激发接触后24、48和72观察反应，按表6进行皮肤反应强度评分。红斑

表6 皮肤反应强度评价

平均反应值＝[∑(1)＋(2)]/合计动物数由于化学物的接触致敏作用并非完全遵循一般的毒理学剂量 - 反应规律。 Maghusson按动物致敏百分数提出以下分级标准(表7)。

表 7 致敏率

5.5.2.6 结果评价本试验适用于弱致敏物（化学原料）的筛选。凡能引起10％以下动物致敏，即1／15或1／20动物致敏，可认为该受试物为弱致敏物，依以上分级标准类推。由于人群中变态性接触性皮炎的发生因素复杂，受到诸多因素如化学物的使用浓度、接触频数、持续时间及接触时原皮肤的健康状况等的影响，试验所得阳性结果应结合人群斑贴试验和流行病学调查进行综合性分析和评价。

5.5.3局部封闭涂皮法（Buehler test，简称BT）

5.5.3.1实验前24h，用脱毛剂将豚鼠背部左侧3cm×3cm范围区脱毛。

5.5.3.2将受试物0.1～0.2ml涂在2cm×2cm滤纸上，并将其敷贴在去毛区，二层纱布一层油纸覆盖，再以无刺激胶布封闭固定，持续6h。第7天和第14天以同样方法重复一次。

5.5.3.3激发接触，即末次致敏后14～28天，将0.1～0.2ml或低于诱导浓度的受试物斑贴于豚鼠背部右侧2cm×2cm去毛区（接触前24h脱毛），然后用二层纱布、一层油纸和无刺激胶布固定6h，将斑贴受试物拿掉，24和48h后观察皮肤反应，按表5评分。对照动物仅给予激发接触。本试验要求动物数每组10～20只。

5.5.3.4结果评价本试验适用于强致敏物（或成品）的筛选。致敏途径与实际接触方式接近，按皮肤反应强度评分标准评价。根据对照组与试验组豚鼠皮肤反应的差别测定变态反应的程度。一般情况下，在豚鼠身上致强过敏物质，可能在人身上引起大量的变态反应，但在豚鼠身上致弱过敏者有可能或不可能引起人体变态反应。