5.9 亚慢性经口毒性试验

5.9.1目的：确定受试物重复经口给予动物可能引起健康的潜在危害，为提供靶器官、蓄积可能性和慢性／致癌性实验提供实验依据。

5.9.2定义：系指动物多次重复经口接受化学物质所引起的不良反应。

5.9.3动物的选择：一般选用啮齿类动物，首选品种为大鼠。使用雌雄两种性别，理想的给药时间是小于6周令。

5.9.4剂量和分组：至少应有三个剂量组和一个对照组，每个剂量组至少20只动物，雌雄各10只。各剂量组选择的原则同亚慢性经皮毒性试验。

5.9.5试验方法：给药方式可采用受试物掺入饲料、饮水或灌胃方式。当受试物掺入饲料时，要确保给药量不能影响动物正常的营养需要。以灌胃方式给药时，每周称体重，并按体重调整给药量，以维持稳定的给药量。在整个实验过程中，动物一般观察、临床检查和病理检查的原则和具体要求，参见亚慢性皮肤毒性试验。

5.9.6试验的意义和价值：亚慢性经口毒性试验将提供重复经口给药后动物所表现的不良反应的资料。虽然从动物实验结果外推到人的正确性是有限的，但它能提供无反应剂量和可允许的人类接触量的有用资料。

5.10 致畸试验

5.10.1目的：致畸试验是鉴定化学物质是否具有致畸性的一种方法。通过致畸试验，一方面鉴定化学物质有无致畸性，另一方面确定其胚胎毒作用，为化学物质在化妆品中安全使用提供依据。

5.10.2定义：胚胎发育过程中，接触了某种有害物质影响器官的分化和发育，导致形态和机能的缺陷，出现胎儿畸形，这种现象称为致畸作用，引起胎儿畸形的物质称为致畸原。

5.10.3器材和试剂

5.10.3.1生物显微镜、体视显微镜、放大镜、扭力天平、游标卡尺、眼科镊子、眼科剪、平皿、滤纸等。

5.10.3.2 1／1000 茜素红溶液：茜素红0.1g，氢氧化钾10g，蒸馏水l000ml。

5.10.3.3透明液A：甘油200ml，氢氧化钾l0g，蒸馏水790ml。

5.10.3.4透明液B：甘油与蒸馏水等量混合。

5.10.3.5固定液（Bouins液）：苦味酸饱和液75份，甲醛20份，冰醋酸5份。

5.10.4实验动物的选择：常用冶实验动物是小白鼠，大白鼠和兔，大、小白鼠为首选动物，选用健康性成熟大鼠90～100天龄，雌性应是初产的。

5.10.5剂量和分组：至少设4组，其中三组给药组和一组空白对照组。每组至少12只孕鼠。初次进行致畸试验或引入新的动物种株时，需要设阳性对照组。常用阳性对照物有敌枯双、五氯酚钠、维生素A等等。根据受试物的动物半数致死量（LD50）和蓄积性的大小，确定采试物的给药剂量，应该包括无作用剂量组，有致畸作用剂量组和明显致畸剂量组。

5.10.6试验方法

5.10.6.1“孕鼠”的检出和给药时间雌鼠和雄鼠按1:1（或2:1）同笼，每日晨观察阴栓，（或阴道涂片），查出阴栓（或精子）的当天定为孕期零天，如果五天内没查出“受精鼠”，应调换雌鼠，检出的“受精鼠”按随机分组，称重和编号。在大鼠孕期6～15天期间，每天灌胃给药，孕鼠于孕期0日、6日、10日、15日和20日称重，并根据体重调整给药量。保持动物室内环境安静，室温控制在20℃～25℃为宜，适当地给孕鼠增加营养，如加麦芽或蛋糕等。

5.10.6.2孕鼠处死和一般检查第20天孕大鼠用20％硫贲妥钠1～1.5ml腹腔注射麻醉断头处死。剖腹腔检查卵巢内黄体数，取出子宫，称重；检查活胎、早期吸收和迟死胎数目。

5.10.6.3活胎鼠的检查逐个记录活胎鼠体重，性别，体长，外观检查头颅外形、面部、躯干、四肢等有无畸形，包括，露脑、脑膨出、眼部畸形（小眼、无眼、睁眼等）鼻孔扩大，单鼻孔、唇裂、脊柱裂，四肢及尾畸形等等。

5.10.6.4胎鼠骨骼标本的制备每窝约2／3活胎鼠以眼科镊子剥皮，小心挖掉胸腹腔内脏，去掉后颈和两肩胛骨之间的脂肪块，然后将胎鼠放入茜素红溶液软化染色。当天下午摇动玻璃瓶2～3次，视气温情况需染色半天至两天，至头骨染红为止，第二（或三）天，将胎鼠换入透明液A，第三（或四）天，将胎鼠换入透明液B，第四（或五）天，胎鼠骨骼染红而软组织的紫红色基本退色，可换入甘油中。

5.10.6.5胎鼠骨骼检查染好的标本连同甘油一起倒入小平皿内，在体视显微镜下，用透射光源，先观察胎鼠全身，然后逐步检查骨骼。首先，测量囱门的大小，矢状缝的宽度，观察是否囱门扩大，矢状缝增宽，头顶间骨及后头骨缺损。然后，检查胸骨的发育和数目，是否胸骨缺失或融合。肋骨常见畸形有融合肋，分叉肋，肋骨中断，缺肋，短肋，波状肋，多肋等；脊柱骨的缺失、融合、纵裂等畸形；另外，检查骨盆，四肢骨等是否有畸形。

5.10.6.6胎鼠内脏检查每窝约1／3活胎鼠浸入Bouins氏液后一周作内脏检查。先用自来水冲去固定液，把胎鼠仰放在石蜡板上，剪去四肢和尾巴，用刀片从头部开始，往下逐渐经颈、胸腹部共切6刀。第6刀切完后，可以用小剪刀剖开腹腔，仔细检查消化系统和泌尿生殖系统各器官的大小、形状以及位置。

5.10.7统计处理和结果评价受精鼠数、受孕鼠败、孕鼠死亡数，有一个以上活胎孕鼠数，用卡方检查；窝平均黄体数、窝平均着床数、窝平均活胎数以及活胎鼠平均体重用t检验；吸收胎和迟死胎用非参数统计，窝畸形率、胎鼠畸形率用非参数统计。结果应能得出受试物是否有母体毒性，胚胎毒性以及致畸性。如果受试物有致畸效应，可以得出最小致畸剂量。为了比较不同化学物的致畸性强度，可用致畸指数来表示：致畸指数＝雌鼠LD50/最小致畸剂量 暂以致畸指数10以下为不致畸，10～100为致畸，100以上为强致畸。致畸危害指数＝最大不致畸剂量/最大可能摄入量 如果致畸危害指数〉300，说明受试物对人危害小，100～300为中等，〈100为大（暂定）。