5.13 鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验（Ames）试验

5.13.1定义：用来测定依赖于组氨酸的菌株产生不依赖于组氨酸的基因突变。碱基型突变剂：它引起DNA分子碱基对置换。移码型突变剂：它引起DNA分于增加或缺失一个或多个碱基对。

5.13.2鼠伤寒沙门氏菌组氨酸缺陷型菌株鉴定菌株：建议使用TA98、TAl00、TA97和、FAl02等四种组氨酸缺陷型鼠伤寒沙门氏菌株。增菌培养：将贮存菌接种于5ml营养肉汤中，于37℃振荡培养l0h。

5.13.2.1氨酸需求试验凡组氨酸营养缺陷型试验菌株只能在补充组氨酸的培养基上生长，而在缺乏组氨酸的培养基上则不能生长。鉴定方法：将试验菌株分别接种于含组氨酸培养基和无组氨酸培养基平板，于37℃培养24h，观察细菌生长情况。结果判断：试验菌株在含组氨酸平板上生长，在不含组氨酸平板上不会生长。

5.13.2.2脂多糖屏障缺陷鉴定 粗糙型突变的微生物，其细胞表面一层脂多糖屏障已经破坏，因此一些大分子物质能穿过菌膜进入菌体内而抑制其生长，野生型菌株或含gal缺失的菌株则不受影响。鉴定方法：含0.1ml试验菌株增菌液的顶琼脂培养液倒人肉汤琼脂平板上，冷凝后中央放置菌圆形滤纸片上，滴上10?l的0.1％结晶紫溶液，经37℃培养24h观察结果。结果判断：在滤纸片周围出现一个透明的抑菌环，说明此菌存在深粗型（rfa）突变。TA98、TAl00、TA97和TAl02均有抑菌环，野生型鼠伤寒杆菌没有抑菌环。

5.13.2.3对氨苄青霉素的抗性鉴定含R因子的试验菌株对氨苄青霉素具有抗性。因R因子大太稳定容易丢失从而使试验菌株丧失R因子的特性，因此需要鉴定R因子是否存在。鉴定方法：将试验菌株于肉汤琼脂平板上划线，然后把沾有氨苄青霉素溶液滤纸条与划线交叉放置，37℃培养24h后观察结果。结果判断：具有R因子的试验菌株（TA98、TA100、TA97和TAl02）有抗氨苄青霉素作用，故滤纸条周围照常生长。

5.13.2.4对紫外线敏感性的试验具有uvrB修复缺陷型的试验菌株，在紫外线照射后仍能照常生长，借此可以证明uvrB突变的存在。鉴定方法：将试验菌株在肉汤琼脂平板上划线，然后用黑纸覆盖平板的一半，在15W的紫外灯下，距离3cm处照射8s，37℃培养24h后观察结果。结果判断：对紫外线敏感的菌株（TA98、TAl00、TA97），仅在没有照射的那一半生长，而具有野生型切除修复酶的菌株（TAl02）仍能生长。

5.13.2.5四环素抗性的鉴定鉴定方法：将试验菌株增菌液在营养肉汤平板上划线，待干后，吸取四环素（8mg／ml）溶液与菌株划线处交叉划线，经37℃培养24h后观察结果。结果判断：对四环素有抗性的TAI02菌株生长不受抑制，对四环素没有抗性的菌株，因此在四环素带的周围有一段生长抑制区。

5.13.2.6阳性突变剂的敏感性的鉴定试验菌株对阳性突变剂的敏感性鉴定结果，参见下表。

5.13.2.7自发回变

测试菌株的回变性

TA97（90一180），TA98（20—50），TAl00（100—200），TAl02（240—320）。经过体外代谢活化系统后的自发回变数，要比不经体外代谢活化系统的自发回变数略高。

5.13.3大鼠肝微粒体酶（S-9）的诱导和制备选健康雄性大白鼠体重200克左右，将多氯联苯溶于玉米油中，浓度为200mg／ml，一次腹腔注射PCB剂量为500mg／kg体重。第五天断头处死动物，处死前12h停食不停饮水。消毒动物皮毛，打开腹腔，取出肝脏后，用0.l5mol／L KCl溶液多次冲洗，每克肝脏加0.15mol／L KCl 3ml后，用剪刀剪碎肝脏，并在玻璃匀浆器中制成肝匀浆，然后在低温高速离心机上，以9000g离心10min，然后分装保存于液氮或-80℃冰箱中。制备S-9的一切器皿均经消毒，全部操作在冰水浴中进行。S-9制备后，其活力必须以标准致癌物进行测定。

5.13.4受试物的剂量选择和常用溶剂受试物的剂量选择范围在0.1?g～5mg或对细菌产生毒性的剂量之间，常用的溶剂为二甲基亚酰胺，除此之外，还可以选择丙酮、二甲基甲酰胺、甲酰胺、95％乙醇等溶剂，最高加入量为0.1ml。每种受试物至少三个剂量，每个剂量至少三个平板。

5.13.5试验方法

5.13.5.1直接平板掺入法：，将含0.5m mol／L组氨酸-生物素的顶层琼脂2.0ml分装于试管中，45℃恒温水浴中保温，然后每管依次加入试验菌株增菌液0.lml、受试溶液0.1ml和S-9混合液0.5ml（需代谢活化时）混匀，迅速倾入底层培养基上，转动平板，使之分布均匀，冷凝固化，37℃下培养48h后，计数每皿回变菌落数。突变试验中，除样品各剂量组外，还应设溶剂对照、空白对照、阳性突变剂对照和无菌对照。

5.13.5.2点试法：方济基本同平板掺入法，不同的是，将含菌液（或S-9混合液）的顶层琼脂倒入底层培养基上，然后取直径约6mm无菌圆形滤纸片放在已固化的顶层培养基中央位置。再滴入受试物溶液或直接将受试物放在平皿中央，37℃培养48h后观察结果。

5.13.6结果评价：如果受试物的回变菌落数超过自发回变菌落数的两倍以上，并经统计学处理证明有剂量-回变反应关系者和可重复性，则定为阳性。

5.13.7培养基和试剂的制备

5.13.7.1

121℃(15 1b)30min高压消毒后，加入0.5m mol／L组氨酸 - 生物素溶液20ml。
5.13.7.2
底层培养基琼脂                        7.5g
蒸馏水                     465ml

121℃(15 1b)30min高压消毒后，加入(V-B)培养基E10ml和40％葡萄糖溶液25ml，混匀，按每皿30ml倒平皿，冷凝固化后倒置于37℃培养箱中24～48h。

5.13.7.3 Vogel-Bonner(V-B)培养基
E硫酸镁(MgSO₄·7H₂O)               10g
枸橼酸(C₆H₈O₇·H₂O)              100g
磷酸氢二钾(K₂HPO₄)              500g
磷酸氢铵钠(NaNH₄HPO₄·4H₂O)     175g
先将后三种溶解后，再加入硫酸镁，待完全溶解后倒入容量瓶中，用蒸馏水稀释至1000ml，分装于锥形瓶里，121℃(15 1b)30min高压消毒。

5.13.7.4 40％葡萄糖溶液称取400g葡萄糖，加入蒸馏水稀释至1000ml，115℃(10 1b)20min高压消毒。

5.13.7.5

121℃(15 1b)30min高压消毒。

5.13.7.6

121℃(15 1b)30min高压消毒后，倒斜面或平皿。用于菌株鉴定或常规试验用菌株保存。

5.13.7.7 0.5m mol／L组氨酸-生物素溶液

D-生物素(分子量247.3)                  30.9mg

L-组氨酸盐酸盐(分子量191.7)            24.0mg
加蒸馏水至                               250ml

121℃(15 1b)20min高压消毒。

5.13.7.8 S-9

MgCL₂-KCl盐溶液                         20µl

6-磷酸葡萄糖^*                         5µmol
辅酶 Ⅱ^*                                4µmol0.2mol／L
磷酸盐缓冲液                  500µl
无菌蒸馏水                             380µl

5.13.7.9盐溶液(1.65mol／L KCl＋0.4mol／L MgCl₂)
氯化钾(KCl)                            61.5g
氯化镁(MgCl₂·6H₂O) 4                     0.7g
蒸馏水加至       500ml121℃（15 1b）20min高压消毒。

5.13.7.10 0.2mol／L硫酸盐缓冲液（pH7.4）
磷酸二氢钠（NaH₂PO₄·2H₂O ）           0.593g
磷酸氢二钠（Na₂HPO₄·l2H₂O ）          5.803g
蒸馏水          100ml121℃(15 1b）20min高压消毒。

5.13.7.11 0.l5mol／L氧化钾溶液 精确称取氧化钾11.l8g，用蒸馏水稀释至l000ml，121℃（15 lb）30min高压消毒，冷却后冰箱保存，用于S-9制备。

5.13.7.12氨苄青霉素溶液（8mg／ml）称取三羟氨苄青霉素80mg，加入0.02N氢氧化钠溶液l0ml。

5.13.1.13 0.1％结晶紫溶液称取结晶紫l0mg，加l0ml无菌水即成。

5.13.1.14四环素溶液（8mg／ml）称取四环素40mg，加入0.02N盐酸溶液5ml，用于四环素抗性试验。