5.14 体外哺乳动物细胞的染色体畸变和SCE检测试验
5.14.1意义：用哺乳动物细胞染色体畸变和姐妹染色单体交换率的检测来评价致突变物是世界上常用的短期生物试验方法之一。方法较简单、快速。
5.14.2试剂配制
5.14.2.1阳性对照物：可根据受试物的性质和结构选择不同之阳性对照物，例如黄曲霉毒素B1和苯并（a）芘等。
5.14.2.2受试物：最好溶于培养液中，也可溶于二甲基亚砜（DMSO）中，其浓度应低于0.5％。
5.14.2.3培养液：采用MEM（Eagle），并加入非必需氨基酸和抗菌素（青、链霉素，按l00IU／ml），胎牛血清按10％加入。
5.14.2.4肝匀浆S-9混合物：
S-9的制备同Ames试验，按下列配方配制S-9混合物：
S-9 0.25ml MgCL2(0.4mol／L) 0.02mlKCL(1.65mol／L) 0.02ml葡萄糖-6-磷酸
1.79mg辅酶Ⅱ（氧化型，NADP） 3.06l5mg用MEM培养液补足至lml。
5.14.3实验程序
5.14.3.1细胞：使用中国地鼠卵巢（CHO）细胞株。
5.14.3.2实验前一天，将1×106，细胞接种于直径为6cm的玻璃培养皿中，放培养箱内待用。
5.14.3.3实验时，吸去培养皿中的培养液，加入一定浓度的受试物，肝匀浆S9，混合物以及一定量不含血清的培养液，放培养箱中反应2h。结束后，吸去含受试物的培养液，用Hanks液洗细胞，加入含10％小牛血清的培养液，放回培养箱，于24h内收获细胞。于收获前4h，加入秋水仙素（终浓度为l?g／ml）。如果用于检测SCE频率，则持受试物与细胞反应结束后，加入含20?mol／L
5-溴脱氧脲苷（BrdU）的培养液，于黑暗的环境下培养27h，加入秋水仙素后4h收获细胞。
5.14.3.4收获细胞时，用0.25％胰蛋白酶溶液消化细胞，待细胞脱落后，加入含10％小牛血清的培养液终止胰蛋白酶的作用，混匀，放入离心管以1000～1200r／min和速度离心5～7min，弃去上清液，加入0.075mol／L
KCl溶液低渗处理，继而以甲醇和冰醋酸液(容积比为3:1)进行固定。按常规制片，作染色体分析用的标本可直接用姬姆萨染液染色，检测SCE频率的标本需进行分化染色，将制备好的玻片通过pH6.8的磷酸盐缓冲液lmin，移入Hoechst
33258液（终浓度为l?g／m1）中l2min，再通过磷盐缓冲液lmin。移入特制的黑盒中，经紫外线照射（30W，距离12cm）
l5min，将玻片移至2×SSC液中，在62℃水浴内1.5h，最后经姬姆萨染色。作染色体分析时，对每一处理组选100个分散良好的中期分裂相进行染色体崎变分析。作SCE频率计数时，选择25个细胞计数SCE频率。
5.14.4结果评价：对染色体畸变率用X2检验，对SCE检测用t检验进行统计学处理，以评价受试物的致突变性。
5.15 哺乳动物骨髓细胞染色体畸变率检测试验
5.15.1意义：在动物以不同途径接触受试化学物后，用细胞遗传学的方法检测骨髓细胞染色体畸变率的增加，从而评价受试物的致突变性，进而预测致癌的可能性。
5.15.2
动物选择：选用成年小鼠或大鼠。
5.15.3
剂量选择：选用1／2、1／5、1／10、和l／20LD50剂量为试验组，另设阳性对照和阴性对照各一组，阳性对照组可用苯，剂量为0.l5ml／只，阴性对照为溶剂对照。每组5只动物。
5.15.4
染毒方式：可用经口灌入的方式，共染毒两次，间隔24h，于第二次给药后6h处死动物，于处死前4h腹腔注射秋水仙素（按剂量4mg／kg）。
5.15.5
实验步骤
5.15.5.1
用颈椎脱臼法处死动物，取出股骨，剃除肌肉等组织。
5.15.5.2
剪去股骨两端，用注射器吸取5ml生理盐水，从股骨一端注入，用l0ml离心管，从股骨另一端接取流出的骨髓细胞悬液。
5.15.5.3
将细胞悬液以l000r／min的速度离心5～7min，去除上清液。
5.15.5.4
加入0.075mol／L KCl溶液7ml，用滴管将细胞轻轻地混匀，放入37℃水浴中低渗处理7min，加入2ml固定液（冰醋酸：甲醇＝1:3），混匀，以1000r／min速度离心5～7min，弃去上清液。
5.15.5.5加入7ml固定液，混匀，固定7min，以1000r／min的速度离心7min，弃去上清液。
5.15.5.6用同法再固定1～2次，弃去上清液。
5.15.5.7加入数滴新鲜固定液，混匀。
5.15.5.8用混悬液滴片，自然干燥。
5.15.5.9用姬姆萨染液染色。
5.15.6读片和结果评价选择分散良好的中期分裂相，在显微镜油镜下进行读片，记录畸变类型。所得各组的染色体畸变率用X2检验进行统计学处理，以评价试验组和对照组之间是否有明差异。
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