佛手柑茨烯内酯⁽¹⁾（Bergapten，或称佛手柑脑，简称佛手内酯）是天然呋喃香豆素。作为香料广泛应用于化妆品中，是光敏性物质。

（一） 薄层色谱定性法

1 适用范围

本法适用于化妆品中佛手内酯的定性测定。

2 原理

样品中佛手内酯经有机溶剂提取，薄层色谱分离和判定。

3 试剂

3.1 合成硅镁吸附剂（Florisil）：60～80目，130℃干燥5小时。在干燥器中保存。

3.2 展开剂：环己烷+四氢呋喃（1+1）。

3.3 佛手内酯标准品的配制：合成硅酸镁载体30g按3.5填充层析柱。佛手内酯油（Bergmot oil）50g注入层析柱吸附，接着注入1，2-二氯乙烷50ml，再注入二氯甲烷50ml缓慢淋洗，然后用乙酸乙酞50ml淋洗。用无水硫酸钠干燥乙酸乙酞洗脱液，过滤后用旋转蒸发器蒸去溶媒。浓缩液用少量的1，2-二氯乙烷溶解。按前述方法注入另一合成硅镁载体（30s）层析柱中，吸附，用100～200ml二氯甲烷淋洗。洗脱液在旋转蒸发器中浓缩，浓缩液进行薄层层析法分取佛手内酯。此时薄层色谱的条件同2.2.2.6。佛手内酯的位置在紫外光254nm照射下R

3.4 佛手内酯标准溶液：称取佛手内酯标准品10.0mg，用20.0ml丙酮溶解此溶液，每毫升含佛手内酯500?g，将此溶液置于冷暗处保存。

3.5 合成硅镁层析柱：取硅镁剂15g用1，2-二氯乙烷配成悬浊液，缓慢注入层析柱中不得产生气泡。制备成层析柱。

3.6 薄层板：取薄层用硅胶30g加约65ml水混合，涂布成厚0.25mm的薄层，在105～ll0℃加热30min。在干燥箱中放冷保存。

4 仪器

4.1 层析柱：内径20mm、长200mm具塞玻璃管。下端塞上玻璃棉。

4.2 紫外线灯：可在254nm附近发射紫外线，功率8W。

5 分析步骤

5.1 样品预处理

精确称取样品（含佛手内酯4?g以上，通常称1～5g⁽⁴⁾放入100ml烧瓶中，加入25ml甲醇、10m1 10％硫酸）。连接回流冷凝器在水浴上加温1小时。放冷后移入分液漏斗。如有沉淀物，用玻璃滤过器No.3过滤。沉淀物用5ml二氯甲烷洗涤，洗液与滤液合并移入分液漏斗。加入150m1 10％氯化钠及10Oml二氯甲烷，振荡混合5min，静止，分取二氯甲烷层。水层再用二氯甲烷萃取两次，每次50ml。合并二氯甲烷，用水50ml洗涤二氯甲烷，用无水硫酸钠脱水。加入正壬烷0.8ml，在旋转蒸发器上浓缩。把浓缩液慢慢加入合成硅酸镁柱中，浓缩管用少量的1，2二氯乙烷洗涤，注入层析柱。柱的上层液流尽时，陆续注入甲酸甲酯＋l，2-二氯乙烷”（1+9）100m1⁽⁵⁾，以同样的流速淋洗佛手内酯，于洗脱液中加入正壬烷0.8m1，用旋转浓缩器浓缩，加丙酮定容到2ml作为样品液。

5.2 测定

距薄层板下端2cm处，将样品液及佛手内酯标准溶液5～20Vg以间隔约1cm分别点样，风干后用展开溶媒展开，用上升法展开约10cm，取出风干，在紫外线照射下观察斑点。从样品液得到的斑点⁽⁶⁾色调及易值与佛手内酯的标准溶液的斑点比较判定。

注解：

（l）佛手内酯即天然呋喃香豆素，存在于各种精油 中。由citrus Bergamia Rissoet Poit的果皮提炼的佛手内酯具有清凉性，主要作为香料广泛应用于化妆中。佛手油中含佛手内酯约0.2～0.5％，是引起过敏性皮炎的物质之一。为了避免日光性皮炎，应使用精制的佛内酯 作香料。

（2）佛手油中含有属于香豆素的梨莓素（5，7-二甲基氧基香豆素）、梨莓素的R

（3）佛手内酯在碱性、酸性、中性条件下有荧光。激发光波长为365m，荧光在碱性时为470nm。中、酸性时为480nm，红外吸收谱图如图2-3-54所示。

（4）部分化妆品(肥皂、润发油等）的取样量大约是合成硅镁用量的1／10，润发油采用0.2g以下便可以定量。

（5）1，2-二氯乙烷使用量在150ml以上时有一部分佛手内酯溶出。

（6）灵敏度：0.5µg、R

（二） 气相色谱法

1 适用范围

本方法适用于测定化妆品中佛手内酯。

2 原理

样品经有机溶剂提出、浓缩，注入具有氢焰检测器的气相色谱仪，进行定性和定量。

3试剂

3.1 佛手内酯标准溶液：同（一）的3.3。

3.2 内标溶液：精确称取2，4，5，4-四氯二苯砜（Tedion）约60mg，用丙酮溶解并稀释至100.0ml。

4 仪器

4.1 带氢火焰离子化检测器的气相色谱仪。

4.2 色谱柱：玻璃制（内径3mm、长1.5m）。

5分析步骤

5.1 样品的预处理

取按（一）有层色谱定性制得的样品溶液1ml，加内标溶液0.5ml作待测样品溶液。

5.2 气相色谱条件

色谱柱：内径3mm、长1.5mm的玻璃柱，内装涂有2％的聚乙二醇20M的经酸洗和硅烷化处理的Chorinsorb W。

柱温：220～250℃。

检测器及进样口温度：270℃。

载气流量：N₂，60m1／min。

空气及氢气流量：H₂： 55m1／min；空气：1.2L/min。

5.3 定性

取标准溶液lml，加内标溶液0.5m1，取5?l按测定条件注入气相色谱。测定佛手内酯和内标物质的保留时间。求得与内标物质峰的相对保留时间。取样品溶液5?l，同样地进行气相色谱分析，求出样品的相对保留时间和标准溶液的相对保留时间比较、定性。

5.4 定量

5.4.1 标准曲线：在内标溶液0.5ml中，加入用丙酮稀释的佛手内酯标准溶液lml。制备1m1溶液中含佛手内酯0.01、0.02、0.05、0.1和0.2mg的标准系列。各取5?l注入气相色谱仪，测定峰高，求得内标物质与佛手内酯的峰高比，以横轴为浓度、纵轴为峰高比绘制标准曲线⁽²⁾。

5.4.2 测定：取样品溶液5?l，按上述条件进行操作。根据佛手内酯的峰高和内标物质的峰高之比由标准曲线来得浓度。

6 计算

c%=A×V/(m×10000)

式中：c——样品中佛手内酯的浓度，%；

A——由标准曲线上查得待测样液中佛手内酯的含量，µg/m1；

V——样品液的总体积，m1；

m－一样品质量，g。

注解：

（1）强极性的2％PEG 20M涂在Chrom0sorbW（AW，DMCS）上可使佛手内酯和梨莓素完全分离，峰型也好，如图2-3-55。

(2)佛手内酯浓度在10～200µg/m1(0.05～1µg)范围内呈线性关系。