1 主题内容与适用范围

　　本标准规定了小鼠肺炎病毒（以下简称PVM）的检验方法、试剂等，适用于检测实验小鼠、大鼠、豚鼠和地鼠的PVM的感染情况。

2 引用标准

　　GB/T 14926.18　实验动物　淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒检验方法

3 材料和试剂

3.1 PVM毒种。

3.2 BHK21传代细胞。

3.3 酶标仪。

3.4 荧光显微镜。

4 检验步骤

4.1 制备ELISA抗原：PVM感染小鼠待发病后取肺脏，研磨，制成10％悬液，3000r/min离心10min，取上清液感染已生长成单层的BHK21细胞，吸附1.5～2h，加维持液培养9～11天，当细胞病变（CPE）达到＋＋＋时收获，浓缩提纯方法见 GB/T 14926.18中4.1.2.2。

4.2 制备IFA，IEA抗原片：PVM感染BHK21或Vero细胞，当CPE达＋＋时，将细胞用胰酶分散，洗涤后，用PBS悬浮，滴片。滴片方法，抗原的鉴定和保存见 GB/T 14926.18中4.2.3。

4.3 制备PVM阳性血清：用PVM病毒抗原免疫SPF小鼠。

4.4 制备PVM阴性血清：采集无PVM病毒感染的小鼠血清，作为阴性血清。

5 检验方法和结果判定

5.1 ELISA法，见GB／T 14926.18中4.1。

5.2 IFA法和IEA法见GB／T 14926.18中4.2。

5.3 血球凝集抑制试验（HI）

5.3.1 材料、设备和试剂

5.3.1.1 恒温培养箱。

5.3.1.2 冰箱。

5.3.1.3 微量震荡器。

5.3.1.4 微量血凝反应板（u型）。

5.3.1.5 微量加样器。

5.3.1.6 血凝抗原：血凝抗原除部分病毒（如痘类病毒）能与感染性颗粒分开外，大部分是与病毒的感染性颗粒相关联，凡培养于鸡胚或组织培养中的病毒及其抗原物质，经离心除去沉淀，均可用作血凝抗原或血凝抑制试验的抗原。

5.3.1.7 红血球悬液：根据不同病毒血凝所需敏感红血球制备悬液，一般将血液保存于阿氏溶液内，用前以pH7.2磷酸缓冲盐水洗三次，再悬于pH7.2磷酸缓冲盐水内。

5.3.1.8 阿氏溶液配制法

　　葡萄糖 2.05g

　　枸橼酸钠 0.8g

　　氯化钠 0.42g

　　蒸馏水 100mL

　　以上药品混合后加热溶化，115℃ 30min灭菌，保存于4℃。

5.3.2 检验程序

5.3.3 操作步骤

5.3.3.1 血凝素滴定：将病毒液用磷酸缓冲盐水（PBS）倍比稀释成不同浓度，每稀释度留0.025mL于微量血凝板孔内，再加0.025mLPBS与0.05mL红血球悬液，摇匀，置4℃或所需温度1h，判定结果时将出现血凝“＋＋”的最高稀释度病毒定为一单位血凝素（作血凝抑制试验当天，先将血凝素效价测定好）。

5.3.3.2 待检血清处理：将被检血清置56℃水浴30min，有的血清含有非特异性抑制素，可用霍乱滤液处理，即1份血清加4份滤液，混匀后置37℃水浴过夜，再置56℃水浴30min，有的血清含有非特异性凝集素，可按血清体积1/10量加入50％红血球悬液置4℃16h或室温2h，然后离心除去血球。

5.3.3.3 血清稀释：自1∶10起作一系列倍比稀释，每稀释度留0.025mL于血凝板孔内，另取1∶10血清0.025mL作血清对照（不加抗原，只加PBS0.025mL）。

5.3.3.4 滴加病毒：于已稀释好的血清孔内（除血清对照孔外）加0.025mL病毒（8或16单位血凝素），摇匀置22℃或所需温度作用30min。

5.3.3.5 血凝毒单位校对：滴加病毒的同时，将8单位血凝素稀释成4单位、2单位、1单位与1/2单位，每孔0.025mL病毒，加0.025mLPBS。

5.3.3.6 血球对照：加PBS0.05mL。

5.3.3.7 滴加红血球悬液：全部试验和对照孔内，均加0.050mL红血球悬液，摇匀置4℃或所需温度1h判定结果。

5.3.3.8 结果判定：判定时以完全不出现血凝的血清最高稀释度为血清的血凝抑制滴度。

　　各孔血凝结果以＋＋＋＋ ＋＋＋ ＋＋ ＋ －表示。

　　＋＋＋＋：红血球一片凝集，均匀铺于孔底。

　　＋＋＋：红血球凝集基本同上，孔底有大圈。

　　＋＋：红血球于孔底形成一个中等大的圈，四周有小凝块。

　　＋：红血球于孔底形成一个小圈，四周有少许凝块。

　　－：红血球完全不凝集，沉于孔底。

6 结果判定

　　当检样出现阳性时，选用同一种方法或另一种方法重试。如为阳性则判为阳性结果。

7 结果报告

　　根据判定结果，作出报告。