1 主题内容与适用范围

　　本标准规定了流行性出血热病毒（以下简称EHF）的检验方法、试剂等，适用于检测大、小鼠的EHF感染情况。

2 引用标准

　　GB／T 14926.18　实验动物　淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒检验方法

3 材料和试剂

3.1 EHF 毒种：76118。

3.2 Vero－E6传代细胞。

3.3 EHF 的单克隆抗体（以下简称McAb）标记荧光素结合物。

3.4 抗大鼠IgG标记辣根过氧化物酶结合物。

3.5 抗小鼠IgG标记辣根过氧化物酶结合物。或葡萄球菌蛋白A（以下简称SPA）标记辣根过氧化物酶结合物。

3.6 冷冻切片机。

3.7 荧光显微镜。

3.8 酶标仪。

4 检验步骤

4.1 制备抗原片：76118病毒感染E₆细胞，每2～3天更换维持液，培养7～10天，用IFA法预测细胞内特异性荧光，当荧光达＋＋＋时，在负压净化台上将细胞用胰酶分散，用磷酸盐缓冲液PBS洗涤，涂片，吹干，冷丙酮固定，吹风时为保证安全应同时用紫外光照射。

4.2 制备ELISA抗原：当预测被76118感染的E₆细胞特异性荧光达＋＋＋时，即可收获培养物，浓缩纯化处理抗原，首先要培养出高滴度的病毒液，并经过高速离心和梯度离心纯化，或者浓缩包被高效价的EHF McAb，再和粗提的EHF抗原结合，使结合上的抗原达到较高特异性，再检查血清样品。

4.3 制备EHF抗血清：

4.3.1 EHF McAb25-1。

4.3.2 EHF免疫用抗原用?-丙内酯灭活再免疫动物。

4.4 EHF阴性血清：采集无EHF病毒感染的大小鼠血清作为阴性血清。

5 检测方法和结果判定

5.1 测EHF病毒抗原：直接IFA法，适用于检测大、小鼠的肺脏，用冷冻切片机将肺脏切成4～5?m薄片，丙酮固定在玻片上，用已知EHF抗体标记荧光素结合物工作浓度和伊文思兰一起混合，37℃水浴孵育40min。

5.2 直接ELISA法查抗原，方法见GB／T 14926.18中4.1.6。

5.3 测EHF病毒抗体。

　　有直接法和间接法两种。

5.3.1 免疫荧光直接阻断试验法

　　将待检血清加到已知EHF病毒株的细胞抗原片上，37℃孵育45min，PBS振荡洗涤3次，吹干。加伊文思兰PBS稀释的25-McAb-FITC结合物。再孵育30min，同上法洗涤，蒸馏水漂洗后，吹干，封片，镜检。

5.3.2 免疫荧光间接阻断试验法

　　将待检血清加到已知EHF病毒株细胞抗原片上，再加25-McAb，最后加羊抗小鼠IgG荧光素结合物，孵育和洗涤方法同前。

　　当检样出现阳性时，选用同一种方法或另一种方法重试，如为阳性可判为阳性结果。

6 结果报告

　　根据判定结果，作出报告。