1 主题内容与适用范围
本标准规定了淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒（以下简称LCM）的检验方法，试剂等，适用于检测小鼠、豚鼠和地鼠的LCM的感染情况。
2 材料和试剂
2.1 LCM毒种。
2.2 Vero传代细胞。
2.3 酶标仪。
2.4 荧光显微镜。
3 检验步骤
3.1 制备ELISA抗原：将LCM病毒接种于Vero细胞，吸附1.5～2h，加维持液培养7～10天，当细胞病变（CPE）在＋＋＋时收获，浓缩提纯抗原方法见4.1.2.2。
3.2 制备IFA，IEA抗原片，将LCM病毒感染Vero细胞CPE达＋＋＋时，
将细胞用胰酶消化分散，洗涤后，用磷酸盐缓冲液（PBS）悬浮，滴片，感染细胞的操作在负压净化台上进行。片子吹干过程需用紫外光照射。滴片程序，抗原的鉴定和保存见4.2.3。
3.3 制备LCM阳性血清：用?－丙内脂灭活LCM抗原，免疫SPF小鼠，免疫豚鼠和地鼠。
3.4 制备LCM阴性血清：采集确证无LCM病毒感染的小鼠、豚鼠和地鼠血清，作为阴性血清。
4 检验方法
4.1 酶联免疫吸附试验（ELISA）
4.1.1 设备和材料
4.1.1.1 酶标仪。
4.1.1.2 聚苯乙烯板，带盖40孔、55孔、96孔均可，用前洗净晾干，紫外光照射一小时。
4.1.1.3 微量加样器，容量5～50?L。
4.1.1.4 微量振荡器。
4.1.2 试剂
4.1.2.1 酶结合物：直接ELISA用特异抗体IgG结合酶，间接ELISA常规用下面两种结合物，可任选一种使用。
a. 抗小鼠、大鼠、地鼠、豚鼠和兔IgG结合辣根过氧化物酶，用于检查相应的动物血清抗体。
b.葡萄球菌蛋白A（简称SPA）结合辣根过氧化物酶。
c.方阵滴定酶结合物举例
将1∶4000稀释的牛痘抗体包被所有孔，孵育，洗涤，叩干，按方阵加入不同稀释度正常抗原和特异抗原，孵育，洗涤后加入已系列稀释抗牛痘IgG酶结合物，以OD值在1.0
左右时的酶结合物的最高稀释度作为酶结合物的最佳工作浓度如下表酶结合物的工作浓度为1∶200。
酶结合物效价滴定
抗原
浓度 |
酶 结 合 物 稀 释 度
|
| 1∶50 |
1∶100 |
1∶200 |
1∶400 |
1∶800 |
1∶1600 |
1
|
2
|
3
|
4
|
5
|
6
|
7
|
8
|
9
|
10
|
11
|
12
|
N
|
S
|
N
|
S
|
N
|
S
|
N
|
S
|
N
|
S
|
N
|
S
|
1∶20
|
0.020
|
2.230
|
0.016
|
1.86
|
0.012
|
1.660
|
0.009
|
0.850
|
0.007
|
0.640
|
0.005
|
0.474
|
1∶40
|
0.012
|
2.100
|
0.010
|
1.750
|
0.010
|
1.400
|
0.006
|
0.740
|
0.006
|
0.510
|
0.004
|
0.405
|
1∶80
|
0.011
|
1.850
|
0.010
|
1.400
|
0.007
|
1.200
|
0.005
|
0.700
|
0.005
|
0.450
|
0.004
|
0.382
|
1∶160
|
0.010
|
1.450
|
0.009
|
1.200
|
0.006
|
1.000
|
0.005
|
0.680
|
0.004
|
0.400
|
0.003
|
0.371
|
1∶320
|
0.009
|
0.840
|
0.008
|
0.750
|
0.005
|
0.800
|
0.004
|
0.600
|
0.003
|
0.380
|
0.002
|
0.350
|
1∶640
|
0.010
|
0.780
|
0.008
|
0.640
|
0.004
|
0.600
|
0.004
|
0.480
|
0.002
|
0.250
|
0.001
|
0.075
|
1∶1280
|
0.011
|
0.600
|
0.007
|
0.550
|
0.004
|
0.510
|
0.003
|
0.350
|
0.002
|
0.150
|
0.001
|
0.035
|
1∶2560
|
0.009
|
0.380
|
0.006
|
0.350
|
0.003
|
0.250
|
0.003
|
0.200
|
0.002
|
0.100
|
0.001
|
0.020
|
N：正常抗原；S：特异抗原。
4.1.2.2 抗原处理和抗原最适浓度测定：
a. 聚乙二醇（PEG M=6000）处理：将感染病毒的细胞培养物冻融三次，10000rpm离心30min，取上清液，根据其体积按10％最终浓度加入PEG，同时加入NaCL（最终浓度为0.85％）置4℃搅拌一小时后，4℃过夜。10000rpm离心一小时，弃上清液，沉淀物加适量PBS，滴定工作浓度，分装－70℃保存。
b.PEG（M=20000）处理：将病毒感染的细胞抗原，用上述方法经冻融，离心，弃细胞残渣，将上清液置透析袋内，袋的周围洒上PEG粉末，置4℃进行反透析，当袋内液体浓缩至5～20倍时，收集液体，经超声波处理，滴定工作浓度，分装－70℃保存。
c. 超速离心处理：将收获感染细胞的病毒培养物，经冻融，超声波处理，10000rpm离心一小时，取上清液，经40000rpm离心4小时，取沉淀物，按原体积的1／40量加入磷酸盐缓冲液（PBS），滴定工作浓度，分装－70℃保存。
d. 梯度密度离心：根据病毒分子量的大小，采用蔗糖或氯化铯在超速水平式离心机作梯度密度离心。
凡是用ELISA法检测鼠群病毒抗体时，必须有正常抗原作对照，正常抗原为未感染病毒的细胞，处理方法同特异性抗原。
e. 抗原最适浓度的滴定，在酶结合物工作浓度已确定的情况下，抗原测定其最适浓度按下列步骤进行。测定特异抗原和正常抗原的蛋白浓度，适当稀释，包被。
抗体浓度
抗原
浓度 |
32
|
16 |
8 |
4 |
2 |
1
|
1
|
2
|
3
|
4
|
5
|
6
|
7
|
8
|
9
|
10
|
11
|
12
|
N
|
S
|
N
|
S
|
N
|
S
|
N
|
S
|
N
|
S
|
N
|
S
|
| 10.3 |
A0.35
B0.21 |
over
over |
0.19
0.13 |
over
1.59 |
0.23
0.15 |
1.38
1.14 |
0.14
0.12 |
0.93
0.86 |
0.11
0.00 |
0.51
0.55 |
0.02
0.02 |
0.31
0.25 |
| 7.4 |
C0.24
D0.18
|
over
over
|
0.24
0.15
|
1.57
1.52
|
0.15
0.23
|
1.33
1.18
|
0.06
0.14
|
0.89
0.90
|
0.10
0.06
|
0.52
0.59
|
0.00
0.02
|
0.31
0.25
|
| 6.18 |
E0.20
F0.27
|
1.54
1.59
|
0.17
0.18
|
1.46
1.51
|
0.11
0.20
|
1.20
1.13
|
0.11
0.13
|
0.86
0.88
|
0.08
0.05
|
0.41
0.53
|
0.02
0.01
|
0.21
0.21
|
| 3.09 |
G0.19
H0.14
|
1.29
1.19
|
0.25
0.40
|
1.17
1.18
|
0.14
0.17
|
0.85
0.86
|
0.12
0.09
|
0.64
0.57
|
0.02
0.02
|
0.48
0.33
|
0.00
0.06
|
0.12
0.18
|
N：正常抗原，S：特异抗原，AB加入特异抗原相同，均为10.3?g/mL，32─加入已知特异抗体不同浓度，1，2行均为32?g/mL，3，4行为16?g/mL依此类推。加入最适浓度的酶结合物。根据上述滴定结果以6.18?g/mL特异抗原包被为最佳浓度。
4.1.3 ELISA 操作步骤（间接法）
| 酶标板（洗净，晾干，紫外线照射1h） |
| ↓ |
| 包被抗原（特异性抗原，正常抗原） |
| 37℃孵育1h，再放↓置4℃冰箱16～18h |
| 洗涤，叩干 |
| ↓ |
| 加待检血清1∶10 |
| 37℃孵育↓1～1.5h |
| 洗涤，叩干 |
| 加酶结合物，37℃孵育1～1.5h |
| 洗涤，叩干 |
| ↓ |
| 加底物，置37℃孵育30min） |
| 加终止液，酶标仪测OD值 |
4.1.4 ELISA法用光密度（OD）值判定阳性方法：有三种。
4.1.4.1 以标本OD 值＞阴性对照平均OD 值加3个标准差作为结果定值的域值 。
4.1.4.2 以P/N 值≥2.1为阳性，P/N 值≤2.1而≥1.5为可疑，P/N 值＜1.5为阴性
|
P／N值＝
|
被检血清与特异性抗原反应OD值－被检血清与正常抗原反应OD值 |
| 阴性血清于特异性原反应OD值－阴性血清与正常抗原反应OD值 |
4.1.4.3 标本OD值＞阴性对照OD值×3判为阳性。
附注：凡正常抗原OD值超出0.1以上应重试。
待检标本为阳性时应重试或做阻断试验。
4.1.5 ELISA─阻断抑制试验
由于不易获得纯抗原或其他因素，ELISA有时会出现非特异性反应，为了判断ELISA的特异性，可用阻断抑制实验。
4.1.5.1 操作步骤
a. 包被特异抗原，37℃1h，4℃过夜。
b. 特异性抗原与待检标本中和处理。
c. 取待检标本，阳性血清对照，阴性血清对照作1∶20稀释，每份血清稀释2个管，每管0.15mL，一管加入特异性抗原0.15mL，浓度为包被用抗原的50～100倍，另一管加正常抗原或用PBS代替作对照，各管置37℃水浴1h，每管吸出0.1mL加入酶标板孔内，按ELISA操作步骤进行。
d. 阻断率计算：见下表
阻 断 物
| |
| 阳性对照 |
阴性对照 |
|
|
待验证标本 |
|
|
| |
|
|
|
A |
B |
C |
| 1# |
2# |
1 |
2 |
1 |
2 |
1 |
2 |
1 |
2 |
|
|
|
| 1.489 |
0.265 |
0.069 |
0.042 |
2.245 |
0.230 |
1.254 |
0.201 |
1.734 |
0.203 |
| 82.40 |
0 |
89.20 |
83.98 |
88.40 |
|
1# 管加正常抗原或PBS测OD值，2#管加特异抗原管。
|
抑制率=1－
|
特异性抗原吸收后OD值（2#管） |
×100％ |
| 正常抗原吸收后OD值（1#管） |
抑制率＞50％为阳性，从上表待验证标本A抑制率为89.20％，B为83.98％，C为88.40％，均＞50％。
4.1.6 ELISA（直接法）
| 酶标板（洗净，晾干，紫外线照射1h） |
| ↓ |
| 包被特异性抗体 |
| （37℃孵育1h，洗涤，叩干，4℃过夜） |
| ↓ |
| 加待检搞原（37℃孵育1h，4℃过夜） |
| ↓ |
| 洗涤，叩干 |
| ↓ |
| 加特异性抗体标记酶结合物 |
| （37℃孵育1h，洗涤，叩干） |
| ↓ |
| 加底物，（37℃孵育30min） |
| ↓ |
| 加终止液，酶标仪测OD值 |
4.2 间接免疫荧光法（IFA）和免疫酶染色法（IEA）
4.2.1 设备和材料
4.2.1.1 荧光显微镜。
4.2.1.2 普通显微镜。
4.2.1.3 印有10～40个小孔的玻片。
4.2.1.4 微量加样器。
4.2.1.5 恒温水箱。
4.2.2 荧光和酶结合物及其滴定
4.2.2.1 抗小鼠、大鼠、地鼠、豚鼠和兔IgG异硫氰酸荧光素结合物用于检查相应动物血清抗体。使用时用含1/20000伊文思兰pH7.2磷酸缓冲盐水（PBS）稀释至合适浓度。
4.2.2.2 抗小鼠、大鼠、地鼠、豚鼠和兔IgG辣根过氧化物酶结合物用于检查相应动物血清抗体。
4.2.2.3 SPA─辣根过氧化物酶结合物可代替抗小鼠、豚鼠和兔IgG
辣根过氧化物酶结合物使用。以上二种结合物使用时用PBS稀释至合适浓度。
4.2.2.4 酶和荧光结合物的滴定：根据结合物的种类选用合适的病毒抗原片（例如：抗小鼠IgG的结合物滴定选用痘苗病毒）滴加1∶10的病毒相应阳性血清于正常细胞和病毒细胞的孔内（阳性血清要与待滴定的结合物同一种属，即抗小鼠IgG结合物要用小鼠的阳性血清，余类推），另滴加阴性血清（与阳性血清同种属）和PBS作对照。参考结合物的工作效价做系列稀释，然后滴加于以上各孔内，最后选择出“＋＋＋＋”
最高稀释度的结合物为正式试验用的稀释度。操作程序见4.2.4。
| 举例： |
|
|
|
|
|
|
| |
|
阳性血清 |
|
|
阴性血清 |
PBS |
| |
|
（1∶10） |
|
|
（1∶10） |
|
| 结合物稀释度 |
1∶25 |
1∶50 |
1∶100 |
1∶200 |
1∶50 |
1∶50 |
| 正常细胞孔 |
－ |
－ |
－ |
－ |
－ |
－ |
| 病毒细胞孔 |
＋＋＋＋ |
＋＋＋＋ |
＋＋＋＋ |
＋＋ |
－ |
－ |
| 病毒细胞孔 |
＋＋＋＋ |
＋＋＋＋ |
＋＋＋＋ |
＋＋ |
－ |
－ |
以上结果结合物的工作稀释度为1：100。
4.2.3 玻片抗原的制备、鉴定和保存。
4.2.3.1 玻片抗原的制备：把待制备抗原的病毒接种于它的敏感细胞上，待细胞出现病变或确知细胞内含有丰富的病毒抗原后进行涂片。方法为：用0.02％EDTA消化细胞成均匀的细胞悬液滴于玻片孔内，同时消化不感染病毒的同批细胞，也滴于同一玻片的孔内，待干放入冷丙酮内，在4℃固定15min。
4.2.3.2 玻片抗原片的鉴定：每批抗原片用相应阳性血清和阴性血清鉴定，方法用IFA或IEA均可。操作程序见4.2.4。
| 举 例： |
|
|
|
| |
阳性血清 |
阴性血清 |
PBS |
| |
（1∶10） |
（1∶10） |
（1∶10） |
| 正常细胞孔 |
－ |
－ |
－ |
| 病毒细胞孔 |
＋＋＋～＋＋＋＋ |
－ |
－ |
| 病毒细胞孔 |
＋＋＋～＋＋＋＋ |
－ |
－ |
即对照孔无反应，而阳性血清的病毒细胞孔有反应，阳性细胞数约30％～
50％，IEA法阳性细胞呈棕黄色至红棕色，IFA法阳性细胞呈黄绿荧光，为合用的抗原片。
4.2.3.3 玻片抗原的保存：抗原片充分干燥，每数片包装于塑料袋内密封，置于－20℃或低于－20℃的冰箱内，可保存一年。
4.2.4 操作程序和步骤：
注：* 底物液配方：3，3－二氨基联苯胺盐酸盐40mg，丙酮5mL，33％H2 O20.1mL，PBS100mL。（临用前配）。
4.2.5 结果判定：按下面举例判定，待检血清1∶5阳性判阳性。
| |
待检血清（1∶5） |
阳性血清 |
阴性血清 |
| 1 |
2 |
3 |
4 |
正常细胞孔
病毒细胞孔
病毒细胞孔
|
－
＋～＋＋＋＋
＋～＋＋＋＋
|
±
＋＋～＋＋＋＋
＋＋～＋＋＋＋
|
＋～＋＋＋＋
＋～＋＋＋＋
＋～＋＋＋＋
|
－
－
－ |
－
＋＋＋
＋＋＋
|
－
－
－ |
| 结果判定 |
阳性 |
阳性 |
不能判* |
阴性 |
|
|
注：*遇此情况（即正常细胞对照孔和病毒细胞孔的反应相同）不能判结果，可重试或用其他方法重试。
5 结果判定
当检样出现阳性时，选用同一种方法或另一种方法重试。如为阳性则判为阳性结果。
6 结果报告
根据判定结果，作出报告。
|
