| 食品卫生微生物学检验 椰毒假单胞菌酵米面亚种检验 |
| GB/T 4789.29—1994 |
1 主题内容与适用范围
本标准规定了椰毒假单胞菌酵米面亚种检验的基本要求、操作程序和结果判定。
本标准适用于酵米面、变质鲜银耳及其他淀粉类发酵食品引起食物中毒的病因学诊断及椰毒假单胞菌酵米面亚种的常规检验及菌种鉴定。
2 引用标准
GB 4789.28 食品卫生微生物学检验染色法、培养基和试剂
GB 11675 银耳卫生标准
3 设备和仪器
3.1 超净工作台。
3.2 采样勺。
3.3 灭菌平皿：直径9cm，12cm。
3.4 灭菌试管、吸管。
3.5 灭菌三角瓶：100mL，500mL。
3.6 灭菌L形玻璃棒。
3.7 灭菌透明玻璃纸、滤纸。
3.8 小试管(血清凝集试验用)。
3.9 离心管。
3.10 玻璃漏斗。
3.11 接种针、接种环。
3.12 酒精灯。
3.13 玻片、染色缸。
3.14 显微镜(带油镜头)。
3.15 天平。
3.16 pH计。
3.17 恒温水浴锅。
3.18 恒温培养箱：36±1℃、26±1℃。
3.19 电冰箱：4～20℃
3.20 离心机：4000r/min。
4 培养基和试剂
4.1 革兰氏染色液：按GB 4789.28配制。
4.2 氧化酶试验：按GB 4789.28执行。
4.3 马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)：按GB 4789.28配制。
4.4 马铃薯葡萄糖半固体琼脂：按4.3PDA配方，琼脂量减至0.5g/100mL。
4.5 马铃薯葡萄糖水(PD水)：按4.3PDA配方，不加琼脂。
4.6 GVC增菌液(椰毒假单胞菌酵米面亚种增菌用)：在高压灭菌的PD水(4.5)中，以无菌手续加龙胆紫水溶液(最终浓度为1/10万)，氯霉素水溶液(最终浓度为20?g/mL)，混匀、分装后置4℃备用。
4.7 卵黄琼脂：按GB 4789.28配制。
4.8 SS琼脂：按GB 4789.28配制。
4.9 Hugh－Leifson培养基：(O/F试验用)：按GB
4789.28配制。
4.10 蛋白胨水(靛基质试验用)：按GB 4789.28配制。
4.11 缓冲葡萄糖蛋白胨水(MR和VP试验用)：按GB
4789.28配制。
4.12 西蒙氏柠檬酸盐培养基：按GB 4789.28配制。
4.13 苯丙氨酸培养基：按GB 4789.28配制。
4.14 糖发酵管：按GB 4789.28配制。
4.15 半固体琼脂：按GB 4789.28配制。
4.16 抗O多价血清、型特异性因子血清(O－Ⅲ、O－Ⅳ、O－v、O－Ⅵ、O－Ⅶ型、O－Ⅷ型)。
5 检验程序
椰毒假单胞菌酵米面亚种检验程序如下：
（略）
6 操作步骤
6.1 增菌
用无菌操作取样品25g，加入盛有225mL增菌液的500mL三角瓶中(鲜银耳样品取1g，用剪刀剪碎，加入盛有20mL增菌液的100mL三角瓶中)放36±1℃培养48h。
6.2 分离、纯化培养
取增菌液1接种环，划线接种PDA平板，36±1℃培养24～48h。观察平板上生长菌落的形态，挑取可疑单个菌落，进行革兰氏染色及氧化酶试验。革兰氏染色阴性，氧化酶试验阴性的菌落再点种卵黄琼脂平板及Ss琼脂平板，36±1℃分别培养48h和24h。椰毒假单胞菌酵米面亚种在不同分离平板上的菌落特征见表1。
表1
（表略）
从卵黄琼脂平板挑取卵磷脂酶阳性，并带有虹彩环的单个菌落，接种PDA斜面，36±1℃培养24h，供下步试验用。
6.3 生化试验
从纯培养的PDA斜面上挑取少量菌苔，分别接种Hugh－Leifson培养基、蛋白胨水、缓冲蛋白胨水、西蒙氏柠檬酸盐培养基、糖发酵管及苯丙氨酸培养基，36±1℃培养，按单项试验的要求分别进行观察。椰毒假单胞菌酵米面亚种生理生化性状见表2。
表2
（表略）
6.4 血清学分型鉴定
6.4.1 O抗原的制备
将马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)斜面36±1℃，24h培养物用灭菌生理盐水洗下，煮沸2h，再用灭菌生理盐水稀释至5～10亿/mL菌悬液，作为凝集试验用抗原。
6.4.2 O抗原的鉴定
用多价血清做玻片凝集试验，同时用生理盐水做对照。
与多价血清凝集者，依次用O－Ⅲ、O－Ⅳ、O－v、O－Ⅵ、O－Ⅶ、O－Ⅷ因子血清做试管凝集试验。根据试验结果，判定O抗原型。在生理盐水中自凝者不能分型。
生化学性状符合，但不能与以上血清凝集者，需保留菌株做进一步的鉴定。
6.5 毒性试验
6.5.1 产毒培养
取已鉴定为椰毒假单胞菌酵米面亚种的菌株接种PDA斜面，36±1℃，培养24h，加入3mL灭菌生理盐水，制成约100亿/mL的菌悬液，用无菌吸管吸取0.5mL，滴在铺好灭菌玻璃纸的半固体PDA平板上用灭菌L形玻璃棒涂布均匀，26±1℃培养5d。取下带菌的玻璃纸，将半固体平板放入消毒锅内，100℃流动蒸气灭菌30min。室温冷却后，置-10～-20℃冰箱过夜。将冰冻好的半固体平板置室温融化，用灭菌吸管取出冻融液，经滤纸过滤放灭菌试管或三角瓶中，4℃避光保存，此为粗毒素。
6.5.2 毒力测定
取粗毒素或经水浴蒸发的5～10倍浓缩液0.5mL，灌胃小白鼠3只，体重18～20g，观察7d。若菌株产生米酵菌酸，小白鼠在灌胃后20min～24h内发病、死亡。主要症状为竖毛，萎糜不振，继而躁动，行步蹒跚、肢体麻痹、瘫软、抽搐，呈角弓反张状，呼吸急促、死亡。
6.5.3 米酵菌酸测定
按照GB 11675执行。
附加说明：
本标准由卫生部卫生监督司提出。
本标准由中国预防医学科学院营养与食品卫生研究所及卫生部食品卫生监督检验所负责起草。
本标准主要起草人孟昭赫、刘秀梅、白竟玉。
本标准由卫生部委托技术归口单位卫生部食品卫生监督检验所负责解释。 |
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