| 食品卫生微生物学检验 常见产毒霉菌的鉴定 |
| GB/T 4789.16—1994 |
1 主题内容与适用范围
本标准规定了食品中常见的产毒霉菌的鉴定方法。
本标准适用于曲霉属、青霉属、镰刀菌属及其他菌属的产毒菌种的鉴定。
2 引用标准
GB 4789.28 食品卫生微生物学检验染色法、培养基和试剂
3 设备和材料
3.1 显微镜。
3.2 目镜测微计。
3.3 物镜测微计。
3.4 温箱。
3.5 冰箱。
3.6 无菌接种罩。
3.7 放大镜。
3.8 酒精灯。
3.9 接种钩针。
3.10 分离针。
3.11 滴瓶。
3.12 载物玻片。
3.13 盖玻片：18mm×18mm。
3.14 小刀。
4 培养基和试剂
4.1 乳酸－苯酚液：按GB 4789.28中3.24规定。
4.2 察氏培养基：按GB 4789.28中4.77规定。
4.3 马铃薯、葡萄糖琼脂培养基：按GB 4789.28中4.79规定。
4.4 马铃薯琼脂培养基：按GB 4789.28中4.80规定。
4.5 玉米粉琼脂培养基：按GB 4789.28中4.82规定。
5 操作步骤
5.1 菌落的观察：为了培养完整的巨大菌落以供观察记录，可将纯培养物点植于平板上。方法是：将平板倒转，向上接种一点或三点，每菌接种两个平板，倒置于25～28℃温箱中进行培养。当刚长出小菌落时，取出一个平皿，以无菌操作，用小刀将菌落连同培养基切下1cm×2cm的小块，置菌落一侧，继续培养，于5～14d进行观察。此法代替小培养法，可直接观察子实体着生状态。
5.2 斜面观察：将霉菌纯培养物划线接种(曲霉、青霉)或点种(链刀菌或其他菌)于斜面，培养5～14d，观察菌落形态，同时还可以将菌种管置显微镜下用低倍镜直接观察孢子的形态和排列。
5.3 制片：取载玻片加乳酸－苯酚液一滴，用接种针钩取一小块霉菌培养物，置乳酸－苯酚液中，用两支分离针将培养物撕开成小块，切忌涂抹，以免破坏霉菌结构。然后加盖玻片，如有气泡，可在酒精灯上加热排除。制片时最好是在接种罩内操作，以防孢子飞扬。
5.4 镜检：观察霉菌的菌丝和孢子的形态和特征、孢子的排列等，并做详细记录。
5.5 报告：根据菌落形态及镜检结果，参照以下各种霉菌的形态描述及检索表，确定菌种名称。
6 各种霉菌的形态特征
6.1 曲霉属(Aspergillus)
本属的产毒霉菌主要包括黄曲霉、寄生曲霉、杂色曲霉、构巢曲霉和棕曲霉。这些霉菌的代谢产物为黄曲霉毒素、杂色曲霉素和棕曲霉毒素。
曲霉属的颜色多样，而且比较稳定。营养菌丝体由具横隔的分枝菌丝构成，无色或有明亮的颜色，一部分埋伏型，一部分气生型。分生孢子梗大都无横隔，光滑、粗糙或有麻点。梗的顶端膨大形成棍棒形、椭圆形、半球形或球形的顶囊，在顶囊上生出一层或二层小梗，双层时下面一层为梗基，每个梗基上再着生两个或几个小梗。从每个小梗的顶端相继生出一串分生孢子。由顶囊、小梗以及分生孢子链构成一个头状体的结构，称为分生孢子头。分生孢子头有各种不同颜色和形状，如球形、放射形、棍棒形或直柱形等。曲霉属只少数种形成有性阶段，产生封闭式的闭囊壳。某些种产生菌核或菌核结构。少数种可产生不同形状的壳细胞。
6.1.1 黄曲霉(A.flavuss)
属于黄曲霉群。在察氏琼脂培养基上菌落生长较快，10～14d直径3～4或4～7cm，最初带黄色，然后变为黄绿色，老后颜色变暗，平坦或有放射状沟纹，反面无色或带褐色。在低倍显微镜下观察可见分生孢子头疏松放射状，继变为疏松柱状。分生孢子梗多从基质生出，长度一般小于1mm。有些菌丝产生带褐色的菌核。制片镜检观察可见分生孢子梗极粗糙，直径10～20µm。顶囊烧瓶形或近球形，直径10～65?m，一般多为25～45?m。全部顶囊着生小梗，小梗单层、双层或单、双层同时生在一个顶囊上；梗基6～10µm×4～5.5µm，小梗6.5～10µm×3～5µm。分生孢子球形、近球形或稍作洋梨形，3～6µm，粗糙(见图1)。
黄曲霉产生黄曲霉毒素，该毒素能引起动物急性中毒死亡，如长期食用含微量黄曲霉毒素的食物，能引起肝癌。
（图略）
6.1.2 寄生曲霉(A.parasiticus)
亦属于黄曲霉群，8～10d菌落2.5～4cm，平坦或带放射状沟纹，幼时带黄色，老后呈暗绿色，反面，奶油色至淡褐色。低倍显微镜下观察见分生孢子头疏松放射状，直径400～500µm，分生孢子梗长短不一，一般为200～1000?m，制片镜检观察，见分生孢子梗光滑或粗糙，近顶囊处宽10～12µm，顶囊近球形或烧瓶形或杵状，直径20～35µm，小梗单层，7～9µm×3～4?m，排列紧密。分生孢子球形，极粗糙，具小刺，直径3.5～5.5?m，未报道过产生菌核。
寄生曲霉的菌株都能产生黄曲霉毒素。
6.1.3 杂色曲霉(A.versicolor)
属于杂色曲霉群。在察氏琼脂培养基上菌落生长局限，14d直径2～3cm，绒状、絮状或两者同时存在。颜色变化相当广泛，不同菌系可能局部淡绿、灰绿、浅黄甚至粉红色；反面近于无色至黄橙色或玫瑰色。有的菌落有无色至紫红色的液滴。分生孢子头疏松放射状，大小为100～125µm。分生孢子梗长度可达500～700µm，宽12～16µm，光滑，无色或略带黄色。顶囊半椭圆形至半球形，上半部或四分之三部位上着生小梗。小梗双层，梗基5.5～8µm×3µm，小梗5～7.5µm×2～2.5µm，分生孢子球形，粗糙，直径2.5～3µm或稍大。有些菌系产生球形的壳细胞(见图2)。
杂色曲霉产生杂色曲霉素，该毒素引起肝和肾的损害，并能引起肝癌。
（图略）
6.1.4 构巢曲霉(A.nidulans)
属于构巢曲霉群。菌落生长较快，14d直径5～6cm，绒状，绿色，有的菌系由于产生较多的闭囊壳而显现黄褐色，反面紫红色。分生孢子头短柱形，40～80µm×25～40µm。分生孢子梗极短，常弯曲，一般75～100µm，近顶囊处直径3.5～5µm，褐色，壁光滑。顶囊半球形，直径8～10µm。小梗双层，梗基5～6µm×2～3?m，小梗5～6?m×2～2.5µm。分生孢子球形，粗糙，直径3～3.5?m。闭囊壳球形，暗紫红色，直径135～150µm。子囊孢子双凸镜形，紫红色，约5?m×4?m，有两个鸡冠状突起。闭囊壳外面包围着一层壳细胞，淡黄色，球形，壁厚，直径约25µm(见图3）。
构巢曲霉产生杂色曲霉素。
（图略）
6.1.5 赭曲霉(A.ochraceus)
属于赭曲霉群。在察氏琼脂培养基上菌落生长稍局限，10～14d直径3～4cm，褐色或浅黄色，基质中菌丝无色或具有不同程度的黄色或紫色，反面带黄褐色或绿褐色。分生孢子头幼时球形，老后分裂成2～3个柱状分叉。分生孢子梗长达1～1.5mm，直径10～14µm，带黄色，极粗糙，有明显的麻点。顶囊球形，直径30～50µm或更大。小梗双层，自顶囊全部表面密集着生。分生孢子球形至近球形，直径2.5～3µm或更大，常略粗糙。有些菌系产生较多的菌核，初期为白色，老后淡紫色，球形、卵形至柱形，直径达1mm(见图4)。
赭曲霉产生赭曲霉毒素，该毒素是种强的肾脏毒和肝脏毒
（图略）
6.2 青霉属(Penicillium)
本属产毒霉菌，主要包括黄绿青霉、桔青霉、圆弧青霉、展开青霉、纯绿青霉、红青霉、产紫青霉、冰岛青霉和皱褶青霉等。这些霉菌的代谢产物为黄绿青霉素、枯青霉素、圆弧偶氮酸、展青霉素、红青霉素、黄天精、环氯素和皱褶青霉素。
青霉属的营养菌丝体呈无色、淡色或鲜明的颜色，具横隔，或为埋伏型或部分埋伏型部分气生型。气生菌丝密毡状、松絮状或部分结成菌丝索。分生孢子梗由埋伏型或气生型菌丝生出，稍垂直于该菌丝(除个别种外，不象曲霉那样生有足细胞)，单独直立或作某种程度的集合乃至密集为一定的菌丝束，具横隔，光滑或粗糙。其先端生有扫帚状的分枝轮，称为帚状枝。帚状枝是由单轮或两次到多次分枝系统构成，对称或不对称，最后一级分枝即产生孢子的细胞，称为小梗。着生小梗的细胞叫梗基，支持梗基的细胞称为副枝。小梗用断离法产生分生孢子，形成不分枝的链，分生孢子呈球形、椭圆形或短柱形，光滑或粗糙，大部分生长时呈蓝绿色，有时呈无色或呈别种淡色，但决不呈污黑色。少数种产生闭囊壳，或结构疏松柔软，较快地形成子囊和子囊孢子，或质地坚硬如菌核状由中央向外缓慢地成熟。还有少数菌种产生菌核。
6.2.1 黄绿青霉(P.citreoviride)，异名：毒青霉(P.toxicarum)
属单轮青霉组，斜卧青霉系。菌落生长局限，10～12d直径2～3cm，表面皱褶，有的中央凸起或凹陷，淡黄灰色，仅微具绿色，表面绒状或稍现絮状，营养菌丝细，带黄色。渗出液很少或没有，有时呈现柠檬黄色，略带霉味。反面及培养基呈现亮黄色。分生孢子梗自紧贴于基质表面的菌丝生出，一般50～100µm×1.6～2.2µm，壁光滑。帚状枝大部为单轮，偶尔有作一、二次分枝者。分中孢子链约略平行或稍散开。小梗为紧密的一簇，8～12个，大多9～12µm×2.2～2.8µm。分生孢子呈球形，2.2～2.8µm，壁薄，光滑或近于光滑，成链时具明显的孢隔(见图5)。
黄绿青霉的代谢产物为黄绿青霉素，该毒素是一种很强的神经毒。
（图略）
6.2.2 桔青霉(P.citrinum)
属于不对称青霉组，绒状青霉亚组，桔青霉系。菌落生长局限，10～14d直径2～2.5cm，有放射状沟纹，大多数菌系为绒状，另一些则呈现絮状，艾绿色。反面黄色至橙色，培养基颜色相仿或带粉红色。渗出液呈淡黄色。低倍显微镜下分生孢子链为明确的分散柱状。分生孢子梗大多自基质生出，也有自菌落中央气生菌丝生出者，一般50～200?m×2.2～3µm，壁光滑，一般不分枝。帚状枝由3～4个轮生而略散开的梗基构成，12～20µm×2.2～3µm，每个梗基上簇生6～10个略密集而平行的小梗，8～11µm×2～2.8µm。分生孢子呈球形或近球形，直径2.2～3.2µm，光滑或近于光滑(见图6)。
桔青霉产生桔青霉素，该毒素是一种强的肾脏毒。 |
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