| 食品卫生微生物学检验 志贺氏菌检验 |
| GB/T 4789.5—1994 |
1 主题内容与适用范围
本标准规定了食品中志贺菌的检验方法。
本标准适用于食品和食物中毒样品中志贺氏菌的检验。
2 引用标准
GB 4789.28 食品卫生微生物学检验染色法、培养基和试剂
3 设备和材料
3.1 天平：称取检样用。
3.2 均质器或乳钵。
3.3 温箱。
3.4 显微镜。
3.5 灭菌广口瓶：500mL。
3.6 灭菌三角烧瓶：500mL，250mL。
3.7 灭菌平皿：90mm×15mm。
3.8 载玻片。
3.9 酒精灯。
3.10 灭菌金属匙或玻璃棒。
3.11 接种棒，镍铬丝。
3.12 试管架，试管篓。
3.13 硝酸纤维素滤膜：150mm×50mm，φ0.45μm。临用时切成两张，每张70mm×50mm，用铅笔划格，每格6mm×6mm。每行10格，分6行。灭菌备用。
4 培养基和试剂
4.1 CN增菌液：按GB 4789.28中4.17规定。
4.2 HE琼脂：按GB 4789.28中4.21规定。
4.3 SS琼脂：按GB 4789.28中4.22规定。
4.4 麦康凯琼脂：按GB 4789.28中4.24规定。
4.5 伊红美蓝琼脂(EMB)：按GB 4789.28中4.25规定。
4.6 三糖铁琼脂(TSI)：按GB 4789.28中4.26、4.27规定。
4.7 葡萄糖半固体管：按GB 4789.28中4.31规定。
4.8 半固体管：按GB 4789.28中4.30规定。
4.9 葡萄糖铵琼脂：按GB 4789.28中3.8规定。
4.10 尿素琼脂(pH7.2)：按GB 4789.28中3.15规定。
4.11 西蒙氏柠檬酸盐琼脂：按GB 4789.28中3.5规定。
4.12 氰化钾(KCN)培养基：按GB 4789.28中3.16规定。
4.13 氨基酸脱羧酶试验培养基：赖氨酸、鸟氨酸及对照培养基，按GB 4789.28中3.12规定。
4.14 糖发酵管：棉子糖、甘露醇、甘油、七叶苷及水杨昔，按GB 4789.28中3.2规定。
4.15 5%乳糖发酵管：按GB 4789.28中4.32规定。
4.16 蛋白胨水、靛基质试剂：按GB 4789.28中3.13规定。
4.17 志贺氏菌属诊断血清。
5 检验程序
志贺氏菌检验程序如下：
（图略）
6 操作步骤
6.1 增菌
称取检样25g，加入装有225mLGN增菌液的500mL广口瓶内，固体食品用均质器以8 000～10000r/min打碎1min，或用乳钵加灭菌砂磨碎，粉状食品用金属匙或玻璃棒研磨使其乳化，于36℃培养6～8h。培养时间视细菌生长情况而定，当培养液出现轻微混浊时即应中止培养。
6.2 分离和初步生化试验
6.2.1 取增菌液1环，划线接种于HE琼脂平极或SS琼脂平板1个；另取1环划线接种于麦康凯琼脂平板或伊红美蓝琼脂平板1个，于36℃培养18～24h，志贺氏菌在这些培养基上呈现无色透明不发酵乳糖的菌落。
6.2.2 挑取平板上的可疑菌落，接种三糖铁琼脂和葡萄糖半固体各1管。一般应多挑几个菌落，以防遗漏，经36℃培养18～24h，分别观察结果。
6.2.3 下述培养物可以弃去：
a. 在三糖铁琼脂斜面上呈蔓延生长的培养物；
b. 在18～24h内发酵乳糖、蔗糖的培养物；
c. 不分解葡萄糖和只生长在半固体表面的培养物；
d. 产气的培养物；
e. 有动力的培养物；
f. 产生硫化氢的培养物。
6.2.4 凡是乳糖、蔗糖不发酵，葡萄糖产酸不产气(福氏志贺氏菌6型可产生少量气体)，无动力的菌株，可做血清学分型和进一步的生化试验。
6.3 血清学分型和进一步的生化试验
6.3.1 血清学分型
挑取三糖铁琼脂上的培养物，做玻片凝集试验。先用4种志贺氏菌多价血清检查，如果由于K抗原的存在而不出现凝集，应将菌液煮沸后再检查；如果呈现凝集，则用A1、A2、B群多价和D群血清分别试验。如系B群福氏志贺氏菌，则用群和型因子血清分别检查。福氏志贺氏菌各型和亚型的型和群抗原见表1。可先用群因子血清检查，再根据群因子血清出现凝集的结果，依次选用型因子血清检查。
4种志贺氏菌多价血清不凝集的菌株，可用鲍氏多价1、2、3分别检查，并进一步用1～15各型因子血清检查。如果鲍氏多价血清不凝集，可用痢疾志贺氏菌3～12型多价血清及各型因子血清检查。
表1 福氏志贺氏菌各型和亚型的型抗原和群抗原
（图略）
续表 1
（图略）
6.3.2 进一步的生化试验
在做血清学分型的同时，应做进一步的生化试验，即：葡萄糖铵，西蒙氏柠檬酸盐，赖氨酸和鸟氨酸脱羧酶，pH7.2尿素，KCN生长，以及水杨昔和七叶昔的分解。除宋内氏菌和鲍氏13型为乌氨酸阳性外，志贺氏菌属的培养物均为阴性结果。必要时还应做革兰氏染色检查和氧化酶试验，应为氧化酶阴性的革兰氏阴性杆菌。生化反应不符合的菌株，即使能与某种志贺氏菌分型血清发生凝集，仍不得判定为志贺氏菌属的培养物。
已判定为志贺氏菌属的培养物，应进一步做5%乳糖发酵，甘露醇、棉子糖和甘油的发酵和靛基质试验。志贺氏菌属4个生化群的培养物，应符合该群的生化特性。但福氏6型的生化特性与A群或C群相似，见表2。
表2 志贺氏菌属四个群的生化特性
（图略）
6.4 结果报告：综合生化和血清学的试验结果判定菌型并作出报告。
附加说明：
本标准由卫生部卫生监督司提出。
本标准由江西省卫生防疫站负责起草
本标准主要起草人何晓青。
本标准由卫生部委托技术归口单位卫生部食品卫生监督检验所负责解释。 |
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