| 限制性核酸片段多态性分析 |
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每一限制性核酸内切酶在切割DNA分子时都有固定的切点序列，DNA分子中核苷酸排列顺序的变化有可能使该切点丢失或增加。由于不同生物群体的DNA序列千差万别，因而用同一限制性内切酶消化后，所得DNA片段的长度分布也是千变万化的。这种酶切片段长度分布的多样性就称为限制性片段长度多态性(Restriction
Fragment Length Polymorphism， RFLP)，RFLP常用于生物群体的遗传分析。
(一) RFLP的类型 RFLP可分为单碱基突变型和结构重排型两类。单碱基突变型是由于DNA链上发生了单个碱基的替换，而这一碱基又处于限制性内切酶识别位点内，这样使限制性内切酶识别位点发生丢失或获得而产生的多态性，称为单碱基多态性或点多态性。
结构重排型是由于DNA顺序内部发生了较大的变化。这类多态性也可以分成两种类型：第一种是由于DNA序列上发生突变而引起，这些突变包括缺失、重复和插入等。第二种是由于某一区域内所串连的重复顺序拷贝数相差悬殊，DNA的长度变化很大，从而使得这一区域两侧限制性内切酶识别位点的固定位置随重复顺序数的变化而发生位移，所以这一类型RFLP的突出特征是限制性内切酶识别位点本身的碱基没有发生改变，改变的只是相对位置。
(二) RFLP技术的原理和方法 RFLP技术的原理是基于限制性核酸内切酶酶切消化核酸以及标记的DNA探针能与任何序列相似的片段杂交，通过片段长度的变异检测多态性。
1.经典方法 纯化的DNA用限制性内切酶消化后，琼脂糖凝胶电泳分离和溴化乙锭染色直接显示出酶切片段长度的变化。这种变化是因为核甘酸序列变异导致切点的消失或产生，最后使限制性片段长度发生变化。早期使用RFLP方法实际上就是限制性核酸内切酶酶切图谱分析法，这种方法后来广泛用于动物线粒体DNA、植物叶绿体DNA和病原微生物DNA多态性的检测。根据DNA酶切后产生的片段数量和大小分析鉴别DNA间的相似程度。
2.Southern杂交 对于高分子量的DNA(如高等生物的细胞核DNA)在酶切后很难用电泳分开，往往染出连续一片。另外对于酶切后大小相似的片段其核酸序列是否相似，单纯用酶切图谱很难说清，在Southern发明膜上原位DNA杂交后，使多态性分析更为精确和完善，因此进行RFLP分析研究时，现在都需要进行Southern杂交。典型的方法是DNA酶切产物用琼脂糖电泳分离后，把胶反过来放在滤纸上，胶的上方放一张同样大小的硝酸纤维素膜，再铺滤纸和吸水纸，并加一重物，胶下的滤纸浸在NaCl、柠檬酸钠溶液中，借毛细管原理，溶液不断通过胶进入上面的吸水纸层，DNA随溶液从原位转到硝酸纤维素膜上，这就是毛细管转移法。另外还可通过电转移或真空转移法将DNA片段转移至纤维素膜上。转移好的硝酸纤维素膜经80℃烘烤2小时，将DNA片段固定于膜上，用放射性同位素标记的探针与膜一起保温，在复性条件下，凡与探针同源的膜上固定的DNA就能结合上探针，洗去没有结合的探针，放射自显影就显示出与探针同源的DNA片段。简单地讲其过程包括
⑴ DNA的纯化和酶切；⑵ 酶切片段
电泳分离和转移；⑶
标记杂交探针；⑷ 膜上DNA杂交；⑸
同源片段的显示。
现在许多实验室在转移时使用尼龙膜，据称这种膜机械性能好，不易碎，可以反复使用，即用一个探针杂交显示RFLP后，可以洗去探针，用另一个探针和膜上的DNA再杂交，如此重复3-5次，得到数个RFLP；另外尼龙膜上的DNA的固定可以用120℃半小时或紫外线照射几分钟，节省了时间，还可以在碱性条件下直接转移DNA。
对于探针的来源，许多用于RFLP的探针来源于构建的DNA质粒文库，但也有人用PCR方法直接扩增DNA特定序列作为探针。探针的标记主要有两大类，一是用同位素标记，如32P和35S等，早期的RFLP分析就是采用同位素标记探针检测多态性，但这种标记存在一些缺点如半衰期短，标记的DNA不宜保存以及环境污染等问题。另一类是非同位素标记法，这类方法是许多实验室经常采用的方法，如生物素标记法，最简便的是用PCR反应直接将生物素化－11－dUTP作为部分底物合成DNA链，这种产物便可作为核酸探针。另外还有地高辛(Digoxigenin)标记法，辣根过氧化物酶标记法等。
(三) RFLP技术的发展和应用 RFLP最早于1974年作为一种工具用于遗传研究，主要是利用腺病毒连锁的温度敏感性突变对特定的限制性片段长度的差异把这一突变定位到限制性片段的物理图谱上。Zuerner等在研究肾脏钩端螺旋体分型时，采用RFLP技术几乎可将肾脏钩体型内各血清亚型区分出来，即在限制性内切酶切分析的基础上再进行Southern杂交，但单独使用限制性内切酶分析则不能全部区分出各血清亚型，在四株酶切图谱相似的血清株中，用Southern杂交则能逐一加以区别。Torpstra等和Thiermann等也同时指出单独使用限制性内切酶分析也难以区分具有类似酶切图谱的钩体血清亚型。因此辅以核酸杂交的RFLP分析对肾脏钩端螺旋体的流行病学研究及分型鉴别具有重要的实用意义。
(四) 扩增片段长度多态性分析 目前，除了RELP分析外，还开发了DNA扩增片段长度多态性分析，使DNA片段多态性分析技术更为快速和完善。
1.扩增片段长度多态性(Amplification
Fragment
Length Polymorphism，AFLP) 是在聚合酶链反应(PCR)的基础上进行的一种核酸分析方法。PCR发明不久，人们就从已知是多态性的
DNA序列出发，设计一对引物进行扩增，然后用琼脂糖电泳和溴化乙锭染色检查扩增产物在数目和分子量大小上的变化，这种方法与RFLP不同的是以扩增代替了酶切，其优点是避免了RFLP烦琐的DNA酶切、转移和杂交等步骤，而且只需要很少量的模板DNA，缺点是必须事先了解位点的序列，这种AFLP又称为专一扩增多态性(Specific
Amplified Polymorphism，SAP)。如Jefferey等(1988)根据人小卫星DNA的序列，设计引物进行人
DNA的基因扩增，得到高多态性的小卫星扩增图谱，大大减少了模板DNA的需要量。
2.聚合酶链反应/限制性片段长度多态性分析法(PCR/RFLP)，目前有些研究者将PCR和RFLP结合起来对DNA进行研究，即将DNA的特定序列用PCR方法扩增，其扩增产物再用限制性内切酶进行酶切分析。朱沛轩等采用PCR/RFLP方法对100株B群脑炎奈瑟氏菌进行分型研究，根据这类细菌的1类外膜蛋白基因(PorA)设计引物并扩增，受试菌株均扩增出
116bP片段，以限制性酶MspI消化产生6-8条酶切片段，通过对这些片段的长度和数量的分析，结果将受试的100株细菌分为33种RFLP型(B1-B33)，其中B20型内的菌株数量最多
(占31％)，且多有致病性(29/31)，与非致病性的B21、B22酶切图谱中只有个别小片段位置差异，反映出基因突变后一个切点移位导致酶切图谱的微小变化。这种方法分辨率高、重复性好、简单快速。张晓峰等使用PCR/RFLP方法对康氏立克茨氏体的基因型进行了分析，根据立克茨氏体190KD蛋白基因序列设计一对引物并用于扩增来自南非、埃塞俄比亚、摩洛哥、印度及俄罗斯等地的七株立克茨氏体、扩增结果出现三种不同分子量大小的片段，表明这三类菌株的扩增基因中核苷酸排列彼此不同；扩增产物用限制性酶Rsal及Pstl酶切则可得到四种不同的RFLP图谱，进一步表明康氏立克茨氏体各株间基因型存在着差异。
3.随机扩增多态DNA(RAPD) 随机扩增多态DNA(Random
Amplified Polymorphic DNA)是用单个或单个以上的随机引物扩增DNA，产生长度不等的片段，从而进行多态性分析。它与特异性引物扩增有几个不同点：⑴
特异性引物根据多态位点DNA序列设计，一般成对使用各长20bP左右的引物，RAPD引物则完全随机，长度不等，多为8-10bp，一般为单个使用，G＋C含量一般在50％以上；⑵
特异性引物扩增退火温度较高，碱基配对要求严格，RAPD退火温度较低多为
35-36℃，允许适当的碱基错配，从而引发更多的扩增子(Amplicon)，增加监测多态性的能力。RAPD引物的序列完全随机，几乎可以用于任何生物而揭示其整个基因组的多态性，因此得到广泛应用。孔繁荣等在淋球菌菌种鉴定及分型研究中采用RAPD技术用随机引物对淋球苗WⅠ、WⅡ、WⅢ三群的基因组DNA进行扩增、三群细菌均表现出共有的特征性条带以及各群特有的条带，表明三群淋球菌的基因组同源性很高，在“表现型”上的共性占主导地位，另一方面也说明了三群细菌在基因组DNA中存在一定差异，因此根据这种多态性可对细菌进行分类和鉴定。Fekete等采用5个不同的随机引物单独或成双使用对25株不同的布氐杆菌进行随机引物扩增性片段长度多态性研究。对未知DNA序列的布氏杆菌采用随机引物扩增，结果显示在同等扩增条件下，不同的布氏杆菌表现出不同的基因类型，因此根据扩增产生的片段长度多态性可检测诊断特异性菌株，了解布氏杆菌间的基因关系，计算相似系数等。 |
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