【摘要】
目的:　建立一种测定氨甲酰血红蛋白的高效液相色谱法。方法　将血红蛋白经酸水解后，释放出氨甲酸缬氨酸，并进一步转化成缬氨酸乙内酰脲后进行定量分析。结果　线性范围为0～80 mg/L，最低检测量为1.4 µgCV/gHb平均回收率为74.57%，批内变异系数(CV)为8.5%，批间CV为10.9%。并对30例正常人进行测定。结论　该方法快速、灵敏、特异、实用，适于临床常规和研究应用。

Determination of carbamylated haemoglobin by high-performance liquid chromatography　Liu Ding^*, Song Naiguo, Zhu Zhu, et al. ^*Departmant of Laboratory Medicine, Third Military Medical Univeristy, Chongqing 630038
　　【Abstract】　Objective　To estableish a high-performance liquid chromatographic method to measure carbamylated haemoglobin (CarHb).Methods　It was based on the quantification of valine hydantoin formed from the released carbamyl valine reside after acid hydrolysis of haemoglobin.Results　The linearity of the measurement was 0 to 80 mg/L, the lowest detection limit was 1.4 ?gCV/gHb, analytical recovery was 74.57%.The within-run CVs was 8.5%, the between-run　CVs was 10.9%. We measured CarHb in 30 control subjects.Conclusion　HPLC was a rapid, sensitive, specific and precise method. It was suitable for clinical and research application.
　　【Key words】　Chromatography　　Carbamylated haemoglobin

　　氨甲酰血红蛋白(carbamylated haemoglobin, CarHb)是指被异氰酸甲酰化的血红蛋白缬氨酸，其含量常以氨甲酰缬氨酸(carbamyl valine, CV)表示。由于近来发现氮质血症与其关系密切，而受到许多学者的重视^［1，2］。最早分析CarHb的方法是将其水解后进行氨基酸分析^［3］，而后出现了气相色谱法^［4，5］。但这些方法均不宜运用于临床。近来，国外报道了一种快速的高效液相色谱法(HPLC)来检测CarHb的含量^［6］。我们参考此法，对实验条件进行了探讨和改进，建立了检测CarHb的快速、灵敏HPLC法，经实验效果满意，现报道如下。

材料和方法

　　一、主要仪器
　　1.Waters 810系列高效液相层析仪。美国Waters公司。
　　2.Bekcman J_2-21M型高速低温离心机，美国Beckman公司。
　　3.Sysmex F-800型自动血球分析仪，日本东亚株式会社。
　　二、主要试剂
　　1.标准溶液：N-氨甲酰-D.L-缬氨酸(Sigma公司产)用超纯水配成40 mg/L溶液，4℃保存。
　　2.内标准液：N-氨甲酰-D.L-正缬氨酸(Sigma公司产)配成100 mg/L溶液，4℃保存。
　　3.其它溶液：11 mol/L盐酸，17 mol/L醋酸，乙酸乙酯，10 mol/L氢氧化钠，1 mol/L碳酸氢钠。
　　三、检测原理
　　将Hb于酸性环境中，经高温水解并释放出氨甲酰缬氨酸。同时，在高温酸性条件下，氨甲酰缬氨酸能完全地自发转化成缬氨酸乙内酰脲(valin hydantion, VH)将标准与样品同时水解转化，采用内标法来检测VH的含量，从而推算变异系数(CV)的量。
　　四、实验方法
　　1.标本采集：取被检者静脉血约1 ml，肝素抗凝，其中取20 ?l全血于Sysmex F-800自动血球仪上作Hb测定，另取0.5 ml抗凝血作色谱分析。
　　2.标本处理：用生理盐水10 ml洗涤RBC，并离心2 500×g，5分钟，去上清液，并将洗涤后标本存放在-20℃冰箱中，测定时取出即可。
　　3.标本水解：将已处理的标本同标准液(0.5 ml)一起进行水解转化，其方法为各标本中分别加入1 ml的11 mol/L盐酸和17 mol/L醋酸，经酸化后移入水解管中，抽气闭封，置于110℃下水解2小时。取出后冷却，并置于冰水浴中，加入10 mol/L NaOH 2 ml，使pH值接近4，并准确加入100 µl的内标液，然后再加入5 ml乙酸乙酯，并振荡1分钟后于低温高速离心5 000 ×g，10分钟，取出，吸上层液4.5 ml，滴加1 mol/L NaHCO₃ 2 ml，再次于3 000×g，5分钟离心。最后，取上层溶液4 ml置于90℃水浴中，至乙酸乙酯完全挥发，加入50 ?l流动相，即可进样分析。
　　4.色谱条件：层析柱为Waters Nove-Pak C₁₈柱(4 µm，150 mm×3.9 mm)，进样量25 µl，流速1 ml/min，紫外检测波长210 nm，流动相为3%乙腈水溶液，用醋酸调至pH 4左右。
　　5.计算公式：CarHb的浓度按每克血红蛋白中CV的含量来表示。即：
　　其中：a：标本峰高　b：加入标本中内标峰高　c：标准峰高　c：标准管中内标峰高　20为标准的含量(20 µg)　0.5标本体积(ml)　Hb为标本血红蛋白浓度(g/1 000 ml)

结果

1.标准转化后色谱图　2.在转化液中加入CV标准的色谱图　3.洗涤后的标本色谱图　4.未经洗涤的标本色谱图

图1　氨甲酰血红蛋白层析图

　　1.氨甲酰缬氨酸标准液及洗涤后标本、未洗涤的全血标本色谱图：如图1。
　　2.工作曲线：采用内标校正法进行，CV浓度在0～80 mg/L范围内，工作曲线线性关系良好(r=0.999 8)。如图2所示。

图2　氨甲酰血红蛋白校正曲线

　　3.最小检测限：以2倍信噪比值，25 ?l进样量下，为1.4 µgCV/gHb。
　　4.重复性：将1份标本同时作10次平行测定得批内变异为8.5%。另外，在不同时间里作5次测定得批间变异为10.9%。
　　5.回收试验：取1份标本，按标准加入法测定回收率，结果见附表。

附表　CV回收试验结果

讨论

　　1.氨甲酰缬氨酸的转化反应：本法是基于血红蛋白经酸水解后，释放出氨甲酰缬氨酸的原理进行的^［4～6］。但在高温酸性条件下CV极不稳定成自发地转化成VH，因此，我们在最后色谱图中所得到的只是VH的峰高。由色谱图可见，CV出峰时间在3分钟左右，而VH的出峰时间却较晚大约在5分钟，而内标CHV则在6分钟左右。从色谱图1，2中可知2小时的酸化水解后CV较完全地转化成VH，同时，在标本的色谱图3，4中，也未见3分钟时有明显的CV峰。另外，未洗涤的标本因受血清成份干扰大，杂峰多，虽对测定影响小，但对色谱柱污染大，易使柱效降低过快。故建议在检测中标本都应洗涤，除非标本溶血明显。
　　2.标本的预处理：在处理过程中，水解是关键，它直接影响结果的准确性。因蛋白质水解在高温(110℃)强酸中进行，操作较麻烦，有关文献报道使用的均为商品水解管^［2，6］。价格较贵，我们自制了一种玻璃水解管，既易于抽气，又易于封口，使水解在密闭、低气压中进行，避免了酸的挥发和因高温空气膨胀引起的爆裂，效果满意。另外，在乙酸乙酯的挥发过程中，多数文献均采用70℃水浴进行^［4～6］。我们改为90℃，缩短了实验时间，色谱图与检测结果同参考文献较一致，从而使本法更为快速、实用。
　　3.线性与最低检出限：本法CV浓度在0～80 mg/L范围内线性关系良好。该工作范围足以适合临床检测需要。最低检出限易受检测器灵敏度和进样量的影响，应严格控制其参数。
　　4.精密度和准确度：经重复性试验和回收试验可见本法具有重视性好，准确性高等优点，整个检测过程只需5～6小时即可完成。我们运用本法测定了30名健康成人血标本，结果与国外学者报道^［6］近似。说明该法能广泛地运用于临床科研和检测中。
　　志谢　承蒙重庆医科大学临床生化教授王霞文老师指导
参考文献
1Kwan JTC, Carr EC, Barron JL, et al. Carbamylated haemoglobin in normal, diabetic and uraemic patients. Ann Clin Biochem, 1992;29：206-207.
2Davenport A, Jones SR, Goel S, et al. Differentiation of acute from chronic renal impair-ment by detection of carbamylated haemoglobin. Lancet, 1993;341：1614-1617.
3Gillette P, Manning JW, Cerami A. Increased Surrival of sickle cell erythrocytes ofter treatment in vitro with sodium cyanate. Proc Natl Acad Sci USA, 1971;68：2791-2793.
4Fluckiger R, Harmon W, Meier W, et al. Hemoglobin carbamylation in uremia. N Engl J Med, 1981;304：823-827.
5Smith WGJ, Holden M, Benton M, et al. Carbamylated haemoglobin in chronic renal fail-ure. Clin Chim Acta, 1988;178：297-304.