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四种钙离子拮抗剂的高效液相色谱测定

刘　茜　林其燧

　　尼弗地平（nifedipine，Nif）、尼卡地平（nicardipine，Nicar）、尼群地平（nitrendipine，Nitren）和尼莫地平（nimodipine，Nimo）等均属钙拮抗剂，为二氢吡啶类血管扩张剂，通过阻断钙离子在膜内的移动使冠状动脉和外周血管舒张，是治疗心血管病的重要药物。Nicar、Nitren和Nimo比其原型药Nif有更强的血管选择性，直接心肌抑制作用小，给药灵活而不良反应轻微。因个体对这些药物的剂量反应及不同配方剂型的生物利用度差别大，临床上监测血药浓度是必要的。国内外已有高效液相色谱（HPLC）、气相色谱、免疫和化学滴定等方法测定某一钙拮抗剂或其代谢产物的报道，但同时测定这4种药物的方法尚未见报道。与文献比较本方法采用固相提取和某些被测物标准互为内标的方法具有独特优点，方法简便迅速，特异性好，为临床血药浓度监测和药代动力学研究提供了有效的方法。1　材料和方法
1.1　试剂
1．1.1　来源　4种钙离子拮抗剂（山之内药厂赠送，日本）；乙腈（色谱纯，昌化精细化工厂，北京）；磷酸二氢钾（分析纯，红星化工厂，北京）；正丁胺（上海试剂三厂，上海）；甲醇（优质纯，北京化工厂，北京）。
1.1.2　配制　①标准液：分别精确称取恒重的Nif，Nicar，Nitren和Nimo各1．00mg，各置10．0ml容量瓶中，用乙腈定容，即成浓度分别为288．734µmol/L、193．802µmol/L、277．493µmol/L和238．977µmol/L的标准贮存液。避光，置4℃保存。②标准血清：用无药血清分别将上述4种标准液稀释1000倍，即Nif，Nicar，Nitren和Nimo的标准血清浓度分别为0．289µmol/L、0．194µmol/L、0．277µmol/L和0．239µmol/L。避光，－20℃保存。③提取液：乙腈50ml加正丁胺100µl混匀（含正丁胺0．290）。④磷酸缓冲液：称取适量KH₂PO₄，配成20mmol/L溶液。⑤流动相：乙腈：20mmol/LKH₂PO₄＝46∶54，磷酸调pH到4．5，经0．45µm滤膜过滤脱气后循环使用。
1.2　仪器及用品
1．2.1　HPLC　M840数据处理机；M490紫外检测仪；M510泵和MU6K进样器（WatersDivision，Millipore，US）。
1.2．2　分析柱　KYWGC18反相柱，4．6mm×300mm，10µm（北京分析仪器厂）。
1.2.3　提取柱　BoudElutC18/2ml（Analytichem，International，US）。
1.3　标本提取　取提取柱1支，加甲醇约1．5ml用洗耳球对准柱口，轻轻挤压，使之通过，共3次，后以同法用纯水通过3次，最后让水残留柱内约100µl，加血清1ml，用纯水洗柱3次，去除蛋白质，最后将水挤干，加入100µl提取液，停置1分钟后挤出，共4次，收集并混合提取液，在45℃用N₂吹干，取60?l流动相复溶，50µl进样分析。
1.4　色谱条件　以上述分析柱和流动相，在流速1．5ml/min条件下分离，于237nm检测，检测器吸光度满量程为0．001。

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A　钙拮抗剂标准色谱图；　B　血清空白色谱图；C　标准血清色谱图
图1　4种钙拮抗剂色谱图

2　结果与讨论
2.1　色谱分析结果　见图1A，B，C。图1可见4种药物均达到基线分离，峰型尖锐对称。
　　钙拮抗剂在血中的浓度很低，监测血浓度需要足够的灵敏度，影响因素有：
　　(1)样本提取净化程度和回收率：笔者试用正己烷、叔丁基甲醚、氯仿和乙醚等溶剂提取，结果表明不但回收率低（80％）而且干扰峰多，不能采用。选用C18固相提取柱，以含有改性剂正丁胺的洗脱液提取药物成分，样品净化和洗脱的效果好。因采用60?l流动相复溶，不但消除了试剂峰干扰，而且同时把标本浓缩了16．6倍，大大提高了回收率和检测灵敏度。
　　(2)流动相选择：各分析成分能否基线分离、峰型是否尖锐，也是提高检测灵敏度的重要因素。醋酸或其盐类为组份的流动相在本实验选择的对4种药物都敏感的237nm有较强的吸收，致使检测灵敏度降低。而磷酸盐在此波长吸收较弱，故选择以乙腈、磷酸盐适当配比的流动相，它在pH4．5时，各成分都能基线分离且峰型对称尖锐。pH对Nicar的容量因子（k’）有明显影响，见图2。

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图2　流动相pH对4种钙拮抗剂容量因子（k’）的影响

　　(3)干扰实验：对临床使用的23种药物做了干扰实验，其中利多卡因、奎尼丁、卡勃卡因、慢心律、苯巴比妥、茶碱、咖啡因、速尿、甲硫丙脯酸、苯妥英、双氢克脲塞、利眠宁、安室律定、乙胺碘肤酮、心得安、硝基安定、地卡因、普鲁卡因酰胺和朴痫酮等不干扰，安定、地高辛、丙戊酸和卡马西平在高浓度时对本实验有干扰，但治疗浓度时不干扰。
　　(4)波长的选择：经紫外扫描，210nm是4种药物吸收最强的波长，但杂峰多，特异性差；254nm时杂峰明显减少，但光吸收弱；4种药物在237nm都有较强的吸收峰，杂峰少，比较理想。
2.2　方法学的线性、最低检测限、回收率和重复性
　　(1)Nif，Nimo，Nitren和Nicar等的实测最低检测限分别为0．023µmol/L，0．019µmol/L，0．022µmol/L和0．029µmol/L；线性分别达到2．887µmol/L，2．389µmol/L，2．775?mol/L和3．876µmol/L。据文献报道，Nicar常用剂量40mg每日3次，达稳定态的浓度是0．097～0．969µmol/L，Nif治疗药物浓度范围是0．072～0．289µmol/L，Nimo和Nitren的治疗药物浓度尚未见报道，但报道Nimo单剂量峰浓度是0．263?mol/L，因此，本实验的线性范围至少满足以上3种药物监测的要求。是否可满足Nitren监测的要求有待进一步探讨。
　　(2)回收率：每种药均做了高、中、低3种浓度的回收实验，Nif0．144?mol/L，0．288?mol/L和1．44µmol/L；Nimo0．119µmol/L，0．239µmol/L和1．195µmol/L；Nitren0．139µmol/L，0．277µmol/L和1．387µmol/L；Nicar0．145µmol/L，0．388µmol/L和1．454µmol/L，它们的回收率分别为101％～109％，95%～101％，99％～104％和103％～108％。
　　(3)重复性实验：低、中、高浓度（同上述回收率浓度）的批内重复性实验Nif、Nicar、Nitren和Nimo低浓度在n＝12时的CV分别为7．01％，2．24％，6．60％和7．39％；中浓度在n＝14时的CV分别为4．36％，4．38％，4．56％和4．50％；高浓度在n＝13时的CV分别为3．14％，3．06％，2．24％和5．50％。批间重复性实验在n＝8时低浓度的CV分别为4．29％，8．71％，6．58％和7．73％；中浓度为6．32％，6．45％，6．31％和6．07％；高浓度为6．41％，7．18％，7．88％和4．85％。
2.3　互为内标方法的评价　色谱分析中选择内标法是公认的，但本分析没有找到适当的内标物，因此，我们采取某些被测物标准互为内标的方法，因为这4种药物是不会同时服用的，因此有条件互作内标。但Nif是其它3种药物的原型药，除Nif外其它3种可以作为除本身之外的3种药物的内标。实验表明，被测物互为内标有如下的优点：少分离一种成分并可避免内标干扰问题。作法是，当分析某一种药物时，取另一药物的标准物做内标，浓度选择治疗的有效浓度范围。
2.4　避光操作的必要性　4种药物对光有不同程度的敏感性，标准物在不避光的情况下数小时后测定值下降，尤以Nif明显，在日光中极易脱氢成亚硝苯吡啶，原型药于溶剂中半衰期仅15分钟。笔者曾经在完全不避光的情况下2个小时后测定Nif其分解程度大约为50%，但有文献报道Nif和Nitren在乙腈中于暗处可保持6天不降解，因此标准物、标本，质控血清都要避光保存，分析操作全过程应避光进行。

（原载《中华医学检验杂志》1995年第1期）

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