第三章离子色谱分离的类型
3.1 离子交换树脂
离子色谱直接采用了离子交换技术了解离子交换剂即离子交换树脂方面的知识对于深入理解离子色谱是十分有用的下面我们对离子交换树脂作一个大体的介绍
一.离子色谱剂
常规的离子交换反应被人们所识别已经有许多年了早在古希腊时代人们就采用特定的黏土来纯化海水许多天然物质均有离子交换功能如沸石特定的玻璃一些无机氧化物和不溶性盐类但它们的用途比较有限只有到20世纪出现合成树脂的高分子聚合物后才使离子交换技术得到广泛应用最初的合成树脂是由甲醛和不同的多羟基苯化合物缩聚而成的这种离子交换树脂有着广泛的用途随后人们不断合成新的离子交换树脂来增加离子交换树脂的容量和选择性在第一种离子交换树脂合成不久就产生了苯乙烯-二乙烯苯树脂这种树脂牢固并且有很大的通用性
1.高分子聚合物树脂
苯乙烯-二乙烯苯型的离子交换树脂是由苯乙烯和二乙烯苯单体悬浮聚合而得到的这种聚合物具有网状结构如图3.1所示
图3.1苯乙烯-二乙烯苯网状结构
二乙烯苯的交联给予树脂一定的物理强度而通过化学反应引入功能基使之成为有一定容量的离子交换树脂在聚合物合成过程中要注意的是合成过程中的温度混合速度和其他许多因素从而制备具有单分散性的聚合树脂
根据树脂二乙烯苯的含量(即交联度的不同)离子交换树脂可以分为微孔型和大孔型微孔型树脂交联度比较小树脂为软体凝胶状容易发生收缩而大孔型离子色谱树脂交联度比较大树脂为钢性结构树脂内部含有一定的空隙
第二步是在苯乙烯-二乙烯苯的聚合物上引入离子交换基团通过不同的反应产生不同化学性质的树脂它们有各自不同的用途
在离子色谱中用得最多的是磺酸基强酸型阳离子交换树脂和季胺基强碱型阴离子交换树脂磺酸离子交换基的引入通常称为磺化它是由硫酸氯磺酸发烟硫酸等与苯乙烯-二乙烯苯树脂反应在树脂的苯环上接入磺酸基形成的其反应过程如图3.2所示通常的离子交换容量为4.5
mmolg。
将季铵盐引入苯乙烯-二乙烯苯树脂的过程由两个步骤组成树脂的直接胺基化是不可行的因此第一步是修饰树脂形成氯甲基化然后第二步是中间体采用三甲基胺或二甲基胺氨解图3.3为两种季铵盐树脂的反应示意图第一种类型比第二种类型有更强的碱性由于第一步反应可能导致树脂结构的交联因此反应条件必须严格控制以减少副反应产生高的交联度一般其离子交换容量为3.54.0
mmolg。
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图3.3苯乙烯-二乙烯苯的氨化
2.硅胶树脂
多孔硅胶是高效液相色谱最通用的填料也可以作离子交换的填料通常的阴离子交换色谱填料是由硅胶颗粒外层涂上一层含有季胺基的十二烷基甲基丙烯酸酯聚合物(相对分子质量为500)一般的离子交换容量为0.012
mmolg可允许的pH范围为49硅胶层涂以磺化的低相对分子质量的碳氟化合物的聚合物形成阳离子交换树脂这类树脂对分离有机阴阳离子比较理想有时也用于非抑制型离子色谱中
3.2阴离子交换分离
一阴离子交换填料
阴离子交换柱使用的填料为附聚薄壳型阴离子交换树脂与阳离子分离柱使用的填料相似树脂核也是苯乙烯二乙烯基苯的共聚物核外是一层磺化层该磺化层提供了一个与外面的阴离子交换层以离子键结合的表面外面为粒度均匀的单层季铵化阴离子胶乳微粒由于几何原因并非所有磺酸位置都联结季铵化小球可能会留下一些能结合阴离子的磺酸基团一般说来这些留下的磺酸基团对阴离子分离影响不大
树脂最外层的阴离子交换胶乳提供了树脂分离阴离子的能力其分离机理是基于流动相和固定相(树脂)阳离子位置之间离子的交换它表明了用阴离子交换树脂进行离子交换分离的机理淋洗液中阴离子和样品阴离子争夺树脂上的正电荷位置淋洗液中含有一定量与树脂的离子电荷相反的平衡离子在标准阴离子色谱中这种平衡离子为CO2-和HCO3在标准阳离子色谱中为Cl-或NO3-在离子交换进行的过程中由于流动相可以连续提供与固定相(离子交换树脂)表面电荷相反的平衡离子这种平衡离子与树脂以离子对的形式处于平衡状态保持体系离子的电荷平衡随之样品离子与淋洗离子(即平衡离子)交换当样品离子与树脂上的离子成对时样品离子由于库仑力会有一个短暂的停留不同样品离子与树脂固定电荷之间库仑力不同即亲合力不同因此样品离子在柱中从上向下移动的速度亦不同单柱型阴离子色谱法的柱填料通常为pH49的有机酸盐缓冲液因此其柱填料既可用低容量的阴离子交换树脂又可用硅球键合型阴离子交换剂其分离机理是基本相同的但硅球键合型阳离子交换剂的离子交换容量更低一般柱效亦略低
二.阴离子交换平衡
设用阴离子交换树脂BRx为色谱固定相在树脂和淋洗液达到平衡后树脂上吸附的反电荷离子即为淋洗剂阴离子B-x当样品阴离子A-y进入色谱系统后将与淋洗剂阴离子B-x争夺树脂上的正电荷位置这种离子交换过程可用如下方程式表示
离子交换树脂的交换容量越大淋洗剂浓度越小保留体积就越大淋洗剂离子的电荷越高淋洗的能力就越强各阴离子的选择性系数KAB决定其保留特性是衡量该离子对离子交换树脂亲合力大小的标准常用某离子作参比离子来比较一系列离子的选择性系数以上公式如果以校正保留时间表示则为三影响阴离子交换的因素
以上两公式定量地表明了交换容量淋洗剂浓度选择性系数及其他因素对保留值(保留时间或保留体积)的影响详细讨论如下
四影响离子保留的因素
1.离子电荷
样品离子的价态越高对离子交换树脂的亲合力越大保留时间随价数升高而增加一般来说淋洗三价离子需要用高离子强度的淋洗液二价离子用较低浓度的淋洗液而一价离子需要的淋洗液浓度最低
2.离子半径
对电荷数相同的离子离子半径越大越易极化对离子交换树脂的亲合力也越大即随离子半径增加保留时间增长
3.树脂的种类
离子交换树脂的交联度功能基性质及其亲水性的大小等对离子分离的选择性起了很大作用因为它们直接影响样品离子和淋洗离子的分配平衡
一般树脂上季铵基的R基团不同因而亲水性或疏水性不同如果R基的碳链较长疏水性强反之亲水性强
3.3阳离子交换分离
阳离子分离柱使用薄壳型树脂树脂核是惰性而疏水的苯乙烯-二乙烯基苯的共聚物(简称PS-DVB)核的表面是磺化层磺酸功能基以共价键与树脂核共聚物相连由于功能基只存在于树脂基核的表面缩短了这些交换位置与流动相之间的扩散距离因此用较低容量的离子交换树脂可得到高的分离结果
3.4 离子排斥分离
一.离子排斥的分离机理
离子排斥又称为高效离子排斥(HPICE)，在阴离子HPICE中它采用的分离柱较大(9cm250cm)，柱中填充粒度均匀总体磺化的H+型高容量阳离子交换树脂树脂的电荷密度较大。样品阴离子由于受到Donnan排斥不能进入树脂微孔，而非离子型的组分则不受Donnan排斥可进入树脂微孔，树脂上的功能基导致在树脂颗粒间隙的液体和树脂微孔内吸留的液体之间形成一个半透膜强离解的组分，不能透过这个膜进入树脂内孔，因此不被保留非离解组分能透过这个膜进入树脂的微孔内，在这种情况下树脂对组分的保留就是树脂的内微孔体积和树脂表面积的函数。阴离子的保留体积必须介于总的排斥体积(相当于填充柱的间隙体积和树脂微孔体积之和)和死体积之间，即样品离子需用大于排斥体积的淋洗液，将其洗脱理解HPICE分离机理的一个简单方式是与空间排阻色谱比较，空间排阻色谱的分离是以溶质(样品待测组分)进入和移出柱填料内部微孔的能力为基础的，其保留时间取决于溶质的大小和形状离子排斥，也取决于溶质进入微孔的扩散能力，但分析者可改变溶质的离解度来改变其保留时间。例如用改变淋洗的pH值来改变弱有机酸的离解，pH值越高离解的分子越多，由离子排斥作用导致的保留就越小，反之pH值越低，离解越小，由离子排斥作用所引起的保留就越大。
二.影响离子排斥保留的因素
如前所述，离子排斥色谱分离主要取决于组分在树脂内微孔(固定相)的液体和树脂颗粒间隙中的液体(流动相)之间的分配影响，组分在两相间分配的主要因素有以下几个。
1.溶质的pKapKa越大保留时间越长
2.淋洗液的pH值离子的保留时间在很大程度上取决于淋洗液的pH值，pKa值小，于淋洗液pH值的离子将被排斥不能进入树脂的内微孔，在HPICE中虽然存在吸附现象，但选择性主要与被测离子的pKa值有关除淋洗液pH值，之外其他淋洗条件的改变对HPICE选择性的影响不大。
3.溶质的浓度这一点对弱电解质很重要，因为其离解度是浓度的函数。
4.树脂的性质树脂的交联度影响：树脂内的微孔体积交联度越高，微孔体积越小，对组分的分离就越差，当阳离子交换树脂的交联度降低时，电荷密度也随之降低，而后者决定树脂对阴离子的排斥力，因此用低交联度的阴离子交换树脂(即低的电荷密度)能改善在高交联度的阳离子树脂上被完全排斥的离子的分离度。
5.温度：升高温度会增加溶质的离解因而减少保留时间。
6.流速：因为分离程度受扩散控制要求用较低的流速一般小于1mLmin。
3.5 流动相离子分离
流动相离子色谱(MPIC)用疏水性树脂为固定相，用含有离子对试剂的亲水性为流动相，这种方式具有反相离子对色谱的高分离效率和选择性。在高效液相色谱中又被称为离子对色谱，可用于分离多种阴阳离子，特别是疏水性的阴阳离子。一般而言，流动相离子色谱(MPIC)是离子对色谱与抑制电导检测结合的技术离子对色谱，通常采用紫外检测，一般称为反相离子对色谱(RPIPC)MPIC具有电导检测的特点，是离子对色谱，分离后的通用型检测器MPIC特别适合于带有电荷的大分子(例如表面活性剂)和一些不适合于离子交换分离的其他离子。例如脂肪族的季铵盐离子可以附着在离子交换树脂上，在离子色谱分离过程中导致峰形变差或回收率降低，由于离子对的动态特性往往加入有机溶剂于流动相使被测离子不粘附于MPIC的中性树脂上，另外在一些系列被测物的选择性出现问题时可以加入离子对试剂进行改进。抑制电导检测可以用于离子交换也同样可以作为MPIC的检测，通过抑制器后降低了淋洗液中的背景，电导也同时增强了被测物的电导，最新的抑制器可高效地抑制并对有机溶剂兼容。洗涤剂和其它一些化学制造品的成分分析，如离子态表面活性剂或季铵盐化合物，通常采用MPIC进行分析这种技术，还可以用于化妆品中添加剂如链烷醇胺的分析和药品工业中一系列无紫外吸收的离子态物质的分析。
一.分离机理
离子交换选择性是由流动相和固定相相互作用引起的，而与之相反离子对分离的选择性主要是由流动相决定的水相中两种主要组分是离子对试剂和有机溶剂，由这两种组分的类型和浓度的变化来完成设定的分离。离子对试剂是一种大离子态分子，它带有特定被测物的相反电荷，它往往含有一个亲脂区域与固定相相吸，而且有一个电荷区域与被测物作用，用于MPIC的固定相是中性的亲脂性树脂，如聚苯乙烯-二乙烯苯(PSDVB)或键合相硅胶，而且单一的固定相可以用于阴离子或阳离子的分析
，MPIC的分离机理较复杂，一直存在着不同的观点概括地说主要有3种理论。
1.离子对的形成
2.动态离子交换
3.离子间作用
在第一种模式中被测物和离子对试剂间形成一种中性离子对，然后在流动相和固定相之间进行分配保留值可以通过改变流动相中有机溶剂来控制，类似于传统的反相色谱。在动态离子交换模式中认为离子对试剂的亲脂端吸附在固定相上，形成一层动态的离子交换，表面被测物保留在这一表面就像传统的离子色谱一样，在这种情形下流动相中的有机溶剂可以改变离子对试剂在固定相的作用力，从而进一步改变色谱柱容量。
图3.4所示为两种理论的主要作用力，例如一个阳离子被测物(如C+)，可以采用含有辛烷磺酸的乙腈水流动相进行分离，如采用苯乙烯/二乙烯苯色谱柱作固定相，阳离子通过固定相吸附的辛烷磺酸被保留，而在流动相中的辛烷磺酸与阳离子形成离子对，使阳离子可以在流动相和固定相之间分配，在流动相中的乙腈也可以被树脂所吸附，从而降低色谱柱的容量。
图3.4阳离子对作用示意图流动相OSAACNH2O,C+=阳离子ACN=乙腈OSA=辛烷磺酸
第三个模式是离子对试剂参与固定相时形成载入一个辅助的对离子，在这个模式中被测离子的保留取决于几个因素的组合，包括上述两种模式。
二 影响MPIC分离的因素
1.离子对试剂的类型
为了使样品离子能被非极性的固定相保留，必须使其具有足够的疏水性(即亲脂性)，为此在淋洗液中加入一种具有与样品离子相反电荷的平衡离子，与样品离子生成中性疏水的离子对，MPIC的分离取决于这种中性离子对在亲水性的流动相和疏水性的固定相之间的分配，由于柱填料为非离子交换位置的中性大孔树脂，只要选择适当的平衡离子(离子对试剂)，这种柱子就可用于阴离子或阳离子的分离以及疏水性或亲水性组分的分离。
当选用MPIC这种分离方式时，首先必须选择适宜的离子对试剂，常用的阳离子分离的离子对试剂为脂肪族磺酸已，用于非表面活性阳离子的离子对试剂有：丁烷磺酸戊烷、磺酸己烷、磺酸庚烷、磺酸辛烷、磺酸十二烷基磺酸甲苯、磺酸全氟代癸酸、樟脑磺酸和双2乙基己基膦酸，在同一系列化合物如烷基磺酸系列中，试剂分子中的亚甲基数增加，则非表面活性阳离子的保留时间亦增加，但对不同系列的离子对试剂选择性的估计则是相当困难的，一般情况下最佳的离子对试剂是较弱的表面活性剂，这是因为在MPIC中，非表面活性剂样品离子的保留，是通过与表面活性的MPIC试剂生成离子对来进行的，一个高效的表面活性剂，当其平衡离子改变时，它的表面活性剂改变不大，因此在MPIC中的选择性亦不高，在多数应用中己烷磺酸是较好的离子对试剂，为了得到较低的本底电导需要用高纯度的试剂，己烷磺酸是用乙酸酸化己烷磺酸钠制成的，制备时必须尽量除去试剂中的杂质Na+。这种离子对到达中性的树脂表面时，由于相似物质相溶的原理，吸附于其表面离子对的疏水性越强吸附越强，即树脂对离子对的保留越强，乙醇胺分子中的乙烷基使其形成的离子对疏水性较氨基的离子对更强，因此对树脂的吸附也更强，根据这种差异可使两者很好地分离。
用于阴离子分离的离子对试剂，主要是氢氧化钠和季铵化合物包括：氢氧化四甲铵、四乙铵、四丙铵、四丁铵和氢氧化十六烷基三甲烷，一般规律是当离子对试剂中的亚甲基数增加时，非离子活性阴离子(样品离子)的保留增加，若样品阴离子的疏水性较大，应选用分子中亚甲基数较少的离子对试剂，分子中亚甲基数多的离子对试剂能使几乎所有的阴离子被树脂保留，但选择性不好，而且所需平衡时间长，在多数应用中氢氧化四丁基铵是较好的离子对试剂，用电导检测器检测时由于要用化学抑制来降低背景电导值，这些试剂必须为OH-型在溶剂中这种类型的试剂是以阳离子形式存在时与被分离的离子形成中性的离子对
离子对试剂亲水性或疏水性的选择主要取决于被分析离子以及样品基体中其他离子的疏水性一般规律是对亲水性的样品离子选择疏水性的离子对试剂(如TBAOH)而疏水性的样品离子如长链的烷基磺酸盐或其硫酸盐所需离子对试剂的疏水性就较小(如NH4OH)对于离子对试剂可以简单地采用两个规则第一个规则亲脂性离子选择亲水性离子对试剂而亲脂性离子选择亲水性离子对试剂其中亲脂性次序如下阴离子分析离子对试剂次序为氨离子四甲基铵离子四乙基铵离子四丙基铵离子和四丁基铵离子对于抑制电导必须采用其氢氧根形态而阳离子分析的离子对试剂次序为盐酸高氯酸全氟羧酸戊烷磺酸己烷磺酸庚烷磺酸和辛烷磺酸
第二个规则是选择相对分子质量较小的离子对试剂往往有利于分析因为被测物的结构和性质将对被测物试剂络合离子的形成影响较大
对在疏水性的固定相中的溶解度越大其保留就越强即K越大也就是说增加离子对试剂的疏水性可增加离子对在固定相的溶解度当离子对试剂的浓度增加时保留时间也相应增加当离子对试剂的浓度增加到所有阴离子都生成之后其浓度的增加就不再影响保留时间实验表明对于某些离子当平衡离子的浓度大于某一最大值时保留时间反而减少其原因是离子对试剂在高浓度时发生胶束化作用使离子对在流动相中的浓度增加离子对试剂的最佳浓度与所形成的离子对的强度离子对在固定相上吸附的强弱以及离子对试剂有胶束化作用等有关一般情况下分子较大的离子对试剂的浓度应小于0.005molL分子较小的离子对试剂的浓度可大于0.005molL一般典型的离子对试剂浓度在0.520mmolL
3.有机改进剂的类型和浓度
在淋洗液中加入有机改进剂以增加淋洗液的疏水性可使流动相更易接近疏水性的固定相从而改变离子对对固定相的亲合力减少保留时间和改进分离的选择性
有机改进剂的作用有两种方式(1)阻止固定相上吸附离子对试剂从而降低了色谱柱容
量(2)减少流动相的极性影响被测物试剂的离子对进入亲脂环境
有机试剂改进的最优浓度取决于离子对试剂的亲脂性亲脂性强的离子对试剂往往需要比较强的有机改进剂对强保留物质有机改进剂对峰形有明显的改善
常用的有机改进剂有乙腈甲醇和异丙醇也可用普通反相色谱中的其他溶剂其中以乙腈为最好因为它与水的混合物粘度低而且与水的混合吸热反应使淋洗液不易产生气泡被测组分的疏水性越强所需有机改进剂的浓度越高理论上大多数阴离子都可用不同类型和不同浓度的离子对试剂及有机改进剂来分离
4.pH值的影响
当降低pH值时应使阴离子保持在离子状态否则不能产生离子对通常使用硼酸来降低淋洗液的pH值常用的有机螯合剂如亚胺基二乙酸(IDA)亚胺基二乙醛肟(IDAO)硫脲吡啶咪唑打萨宗8-羟基喹啉等都可键联到亲和色谱基体上以亚胺基二乙酸(IDA)为例苯乙烯二乙烯基苯共聚物基体首先进行氯甲基化反应氯甲基醚可由甲醇甲醛与氯磺酸反应产生并立即与共聚物基体反应再与IDA偶联
因此通过调整适当的pH值和选择更强的螯合剂就可以将富集的金属离子洗脱进行分离和检测该色谱柱可以用于富集和去除杂质
另外冠醚也用于离子色谱柱之中在阳离子色谱柱加入适量的键合冠醚可以改变阳离子洗脱次序用于特殊物质的分离和分析如Dionex
CS15色谱柱加入键合了适量的冠醚后K+的保留明显增大使这类色谱柱可以用于复杂基体中痕量的氨和钠离子的测定和高钠中低氨及高氨中低钠的测定这是阳离子交换和螯合树脂组合的结果
3.7其他分离方式
离子色谱除了上述常见的分离方式外还有吸附反相体积排阻等分离方式和它们之间的组合如多维分离等新型分离方式这些分离方式均已经在离子色谱中得到运用它一般在离子色谱的样品处理中采用特别是样品富集浓缩和去除干扰等也有新型的离子色谱同时具有离子交换和反相功能Dionex公司的OmniPac色谱柱就是如此它既可以进行离子交换分离又同时进行反相分离结合离子色谱和高效液相色谱两者的分离优势
第四章离子色谱检测的类型
离子色谱的检测手段主要有电导检测电化学(安培)检测和光度检测电导检测主要用于在水溶液中化合物的酸式离解常数(pKa)或碱式离解常数(pKb)小于7的离子的检测有时也可用于间接法检测安培检测有直流脉冲和扫描3种操作方式用于能发生电化学反应的化合物分析即在某一特定的外加电压下能产生氧化或还原反应的化合物的测定光学检测的工作原理及性能与HPLC完全相同在离子色谱中主要用于通过柱后衍生反应生成在可见光区有较强吸收的离子的测定如过渡金属镧系元素以及磷硅等
离子色谱的检测器是用于连续监测样品被色谱系统分离后的柱流出物的组成和含量变化的装置其作用是将柱流出物中样品组成和含量的变化转化为可供检测的信号以完成定性定量的任务因此检测器是一种信号接收和能量转换装置
对于离子色谱检测器要满足以下几个方面的要求
(1)灵敏度高可以检测出gmL以下溶质的含量
(2)线性范围宽在样品含量有几个数量级变化时也能落在检测器的线性动态范围之内以便准确方便地进行定量测定
(3)响应快以便能快速精确地将流出物转换成能记录下来的电信号
(4)稳定性好对流量温度的变化不敏感
(5)可靠性高操作简单维修方便
(6)噪声低漂移小对冲洗剂组分的变化不敏感从而在进行梯度淋洗时也能测定
(7)JP2不会引起很大的柱外谱带扩张效应以保持高的分离效能
检测器按照用途分类可分为通用型和选择型两类通用型的检测器如直接电导检测器它能连续地测定柱后流出物某些物理参数如电导值的变化这是任何淋洗液都存在的物理量因此具有广泛的适应性但因其灵敏度低且对流动相也有响应因此容易受流动相的组成流速温度等的影响引起较大的噪声和波动它不能使用梯度淋洗限制了使用范围选择型检测器有光度检测器安培检测器它们对检测物质的响应有特异性而对流动相则没有响应或响应很小因此灵敏度很高受操作条件变化和外界环境影响很小可用作梯度淋洗
离子色谱检测器除了上述常用的检测器外已经开发了离子色谱与原子吸收电感耦合等离子体光谱质谱等联用技术并取得了很大的进展检测器的性能指标如下
一噪声和漂移
噪声和漂移是检测器稳定性的主要表现噪声是指与被测物无关的检测器输出信号的随机扰动变化分短期噪声和长期噪声两种如图4.1中(a)和(b)所示分别为短期噪声和长期噪声图(c)为漂移图
短期噪声使基线呈绒毛状因信号频率的波动而引起由有关电子部件的质量和泵的脉动等产生长期噪声反映输出信号随机和低频的变动情况是不规则的变化大部分情况是由于检测器本身不稳定或溶剂不纯温度和流速等的波动所引起的只有通过改进结构和设计更换部件控制周围环境等来加以消除
噪声通常在最高灵敏度下用记录器满量程的百分比来表示也可用检测器自身的物理量来表示
基线随时间的增加而产生的偏离称为漂移如图4.1(c)所示它反映的是信号的连续递增与递减可用一定时间范围内(如1h)信号的变化作为漂移大小的量度它是由于电源电压不稳色谱系统没有达到平衡固定相的流失冲洗剂的变化温度和流量等的波动而引起的要根据不同情况采取相应措施予以消除
二灵敏度
灵敏度是检测器最主要的性能指标它表示一定量的样品物质通过检测器时所给出信号的大小假如所得的分离谱图是以高斯型分布对于微分型检测器此时进入检测器的样品量是随时间或淋洗液体积而变化的当以淋洗液体积为计算单位通过检测器的样品量等于它在淋洗液中的浓度c(gmL)在全部淋洗液体积下的积分值
三敏感度
检测器灵敏度的高低并不等于它检测最小样品量或最低样品浓度能力的高低因为在定义检测器灵敏度S值时并没有考虑噪声的大小而敏感度与噪声的大小是直接有关的通常以2倍的基线浓度(或噪声)Ib作为可检测出的最小测定信号
其物理意义为每毫升淋洗液中含有样品的量进入检测器时产生的信号恰好等于噪声的2倍对于浓度型检测器其单位为gmL(或mgmL)对于质量型检测器其单位为gs(或mgs)
值得注意的是敏感度除与检测器的噪声和灵敏度有关外还与色谱分离条件及各种柱外因素引起的峰的展宽有关通常是把一个已知量的标准溶液直接注入到检测器中来测定其敏感度的大小
四谱峰的扩张
近年来由于离子微型柱的出现和发展加之色谱柱的柱效不断改进和提高在检测器中所造成的色谱峰的扩展变得越来越大除制备色谱外大多数离子色谱的池体积都小于10L在使用细径离子色谱柱时池体积应减少到12L甚至更低不然检测系统所带来的峰扩张问题就会变得很严重因此这时池体检测器与色谱柱的连接接头等都要精心设计不然就会严重影响柱效能和灵敏度
上述6项性能指标是影响离子色谱检测器质量的主要因素使用者在选择检测器时需要把它们综合起来考虑此外检测器对周围环境的适应性操作维修的简易性使用时的耐用可
5.温度的影响
柱温的提高加快了传质过程一般可缩短保留时间而且由于流动相的粘度减少使柱效增加有时还可改善分离度
6.其他添加剂
为了减少多价阴离子的保留往往加入碳酸盐进行加入碳酸盐后对二价阴离子的保留的减弱明显要比一价阴离子的保留减少得更多一般碳酸盐的浓度范围在0.11mmolL之间3.6螯合树脂的分离和富集
螯合树脂是将具有螯合作用的有机官能团偶联在聚合物基体上然后与过渡金属离子生成稳定的螯合物利用螯合物中定位的金属离子与其他物质分离或富集靠性及成本价格的合理性等都是必须考虑的因素
4.1直接电导检测
当电场施加于两电极时溶液中阴离子趋向阳极阳离子趋向阴极溶液中离子数目和迁移速度的大小决定溶液的电导值离子的相对迁移率由其极限摩尔电导值决定离子在电场作用下的运动速度除受离子电荷和离子大小等因素影响外还与温度介质的性质及施加电压的大小有关两极间可以施加直流电压但通常是施加正弦波或方波型交流电压当施加的有效电压确定后测量出电路的电流值即能测出电导值然而由于电极表面附近形成的双电层极化电容(或称法拉第交流阻抗)的影响会引起有效电压的改变因而电路施加于两极的电压不等于有效电压双电层形成机理的解释如下当电极两端的电压低于离子的分解电压时电极附近的溶液层将吸引反电荷的离子形成一双电层此双电层由两部分组成(1)内壁薄层在此层内离子浓度随电极距离的增加而减少呈线性关系
(2)扩散层在此层内离子浓度随电极距离的增加而减少呈指数关系双电层的存在亦会产生电压降实际上施加电压为有效电压(由溶液电阻产生的电压降)和双电层电压降的总和如果施加电压大于分解电压则将发生电解电流通过时阳极表面发生氧化反应阴极表面发生还原反应这种过程产生的法拉第交流阻抗也会延迟电子的转移过程在电极的表面将发生离子的增加或部分离子的消耗同样亦改变了有效电压
为了精确地测量溶液电导的真实值在电导检测器设计中采用多种体系
五电极间施加交流电压及采用有关的测量技术
改变电流方向将使离子运动转到各相反方向倒转电解方式和改变双电层结构当然各种过程变化的延迟时间是不同的随着频率的增高电解过程造成的影响可以减少以至消除电流易通过双电层频率增高的极限值为1MHz因为高于极限值后离子不再发生迁移运动仅发生偶极矩共振在100kHz交流电压下电解和双电层电容的影响已不明显在一些电导仪的电路中可配置一个与双电层电容相匹配的补偿电容构成一桥路以消除法拉第双电层电容的影响另一种设计是采用瞬间电流测量法瞬间电流是指交流电位施加于电极时在脉冲的初期双电层还未形成时测得的电流采用频率为102105Hz的正弦交流电在测量电路中用了同步采样测量技术即仅测出与施加频率相同的瞬间电流
六双脉冲电导测量技术
其特点是在极短的时间间隔(100s)向电极输入两个电压脉冲这两个脉冲的周期相同,辐度相等唯电压相反电路设计中只采样测量第二脉冲终点时的电流在此点电导电流服从欧姆定律不受双电层电容的影响也不会发生电解故可准确测量出电导值它采用8085芯片作为中心处理器(CPU)通过处理机输入输出部件(PIO)对其他单元进行控制由CPU时钟分频触发后产生双极脉冲经整形后送至电导池电导池返回的信号在第二个脉冲的后沿被采样保持转换为一个直流信号此信号与温度测定信号交替送入电压频率变换器数字信号送至CPU在进行补偿时CPU将这个信号处理后通过DA(补偿)转换器送回放大电路对原信号进行补偿直至比较输出为OK状态信号输出也是通过VF变频电路送至CPUCPU对其处理后通过DA(输出)变频电路经驱动器输出至数据处理器其结构见图4.4
图4.4美国Dionex公司电导检测器示意图
CPU中心处理器PIO处理机输入输出部件1双极化脉冲发生器2整形驱动电路3电导池4放大器5采样保持器6比较器79数字模拟转换器(DA)8模拟数字转换器(AD)10驱动器11前面板12记录仪
七四电极或五电极电导仪测量技术
用四电极或五电极电导测量技术能有效地消除双电层电容和电解效应的影响图4.5为五电极电导检测器的结构示意图及等效电路。
图4.5五电极式电导检测器14施加电压电极23测量电极5屏蔽电极
其结构特点是在流路上设置四个电极14为两个施加电压电极两极间施加20004000Hz的正弦波或方波交流电压23为两个测量电极在电路设计中维持两测量电极间电压恒定不受负载电阻1和2电极间电阻3和4电极间电阻和双电层电容变化的影响因此两测量电极间的电流变化只与溶液的电阻有关从而控制电路中的电流使之仅随溶液电阻发生变化再从负载电阻两端取出信号进行放大和显示第五电极为屏蔽电极有助于提高测量的稳定性五电极电导检测器有效地消除了极化和电解效应的影响在高背景电导下仍能获得极低的噪声水平非常适于作单柱离子色谱的检测器
4.2抑制电导检测
抑制电导检测法所用的电导检测器与单柱型离子色谱电导检测器相似但抑制电导通过了抑制器使背景电导大大降低因此它采用的电导检测器相对要求比较低一般不采用五电极电导检测器也可以不加温度保护而抑制电导检测的基础是抑制器反应它是构成离子色谱的高灵敏度和选择性的重要因素因此我们在这里主要介绍抑制反应和抑制器
一抑制反应
采用淋洗液的抑制和电导检测器的离子交换色谱即抑制型离子色谱它是一种利用改变样品离子对固定相的相反电荷离子的亲合力的分离技术所用淋洗液必须是离子型的水溶液H.
Small创始离子色谱的时候有几种检测方式可用其中电导检测器是最吸引人的因为它对水溶液中的离子具有通用性然而正因为它的通用性作为离子色谱的检测器它本身就带来一个问题即对淋洗液有很高的检测信号这就使得它难以识别淋洗时样品离子所产生的信号H.
Small等人提出了一个简单而巧妙的解决方法他们选用弱酸的碱金属盐为分离阴离子的淋洗液当分离阴离子时使淋洗液通过置于分离柱和检测器之间的一个氢(H+)型强酸性阳离子交换树脂填充柱分析阳离子时则通羟基(OH-)型强酸性阴离子交换树脂柱子这样阴离子淋洗液中的弱酸盐被质子化生成弱酸阳离子淋洗液中的强酸被中和生成水从而使淋洗液本身的电导大大降低这种柱子称为抑制柱
在阴离子分离中最简单的淋洗液是NaOH淋洗离子OH-从分离柱的阴离子交换位置,置换待测阴离子当待测阴离子从柱中被洗脱下来进入电导池时要求能检测出洗脱液中电导的改变但淋洗液中OH-离子的浓度必须较样品阴离子的浓度大得多才能保持分离柱的线性工作范围因此与淋洗液的电导值相比由于样品离子进入淋洗液中所引起的电导的改变就非常小其结果是用电导检测器从抑制柱流出的洗脱液中淋洗液(NaOH)已被转变成电离很小的水因此其电导值也很小而样品阴离子则变成其相对应的酸抑制柱反应是一种新型的柱后反应它同时起了两个非常重要的作用第一转变样品阴离子为相对应的酸而由于H+离子的极限摩尔电导是其他阳离子的7倍大大提高了所测阴离子的检测灵敏度第二将淋洗液离子转变为很弱的酸或水使其检测灵敏度大大降低以上两种作用同时改善了信噪比使阴离子检测得到较高的灵敏度
在阳离子分离中也用相似的柱后化学反应一般用无机酸为淋洗液淋洗液进入阳离子交换柱之后进入填充OH-型高容量阴离子交换树脂的抑制柱抑制柱反应将酸(即淋洗液)转变成中性的水与此同时将样品阳离子(C+)转变成其相应的碱
抑制反应的结果不仅降低了淋洗液的检测灵敏度而且由于OH-离子的离子极限摩尔电导为一般离子的3倍因而提高了所测阳离子的检测灵敏度
使用抑制器可以显著改善强酸碱离子的信噪比但是对弱酸碱而言抑制器的中性pH值流动相会降低其离子化程度因此检测灵敏度提高不多但是由于背景电导的下降信噪比仍然高于非抑制型电导检测抑制电导有如下优点
(1)低检测限
(2)分析样品的浓度下降(检测稀释样品可以延长柱子寿命)
(3)线性范围加大
(4)使用高浓度流动相可以进行更宽范围的淋洗液控制并允许增加样品浓度或进样体积二抑制器种类
1.填充抑制柱
离子色谱中所用的第一代抑制柱是树脂填充抑制柱所用树脂为中到高交联度的常规强酸型阳离子和强碱型阴离子交换树脂在抑制过程中阴离子抑制柱树脂逐渐从H+型变成Na+型阳离子抑制柱树脂逐渐从OH-型变成Cl-(或NO-3)型由于抑制柱积累了来自淋洗液中的Na+离子或Cl-离子会逐渐失去抑制能力需要定期分别用酸或碱进行再生使其恢复到原来的抑制能力
填充抑制柱的一个主要问题是再生前的使用时间用高容量离子交换树脂填充的抑制柱具有较长的使用寿命
填充抑制柱的另一个主要问题是弱酸阴离子和弱碱阳离子在阴阳离子抑制柱中的行为例如在阴离子抑制柱中当样品离子Cl-进入H+型抑制柱与抑制柱中H+型树脂接触时即转变成HCl一般情况下HCl是完全离解的Cl-会相继通过抑制柱的其余部分但这只限于抑制柱中树脂颗粒之间的间隙体积抑制柱树脂具有高的电荷密度其离子交换位置的负电荷与Cl-离子相同这就使Cl-离子进入抑制柱时由于受到Donnan排斥的阻碍不能进入树脂的微孔内未经转变为HCl的NaCl中的Cl-也是完全离解的也不能进入树脂的微孔
现在来讨论弱酸阴离子如NO2通过抑制柱的行为当NO2以NaNO2形式存在时它与Cl-一样受到Donnan排斥当NO-2与抑制柱中H+接触时NO-2就从NaNO2转变成HNO2因为HNO2是较弱的酸即使在稀溶液中也有相当大部分HNO2处在不离解状态未离解的HNO2不受Donnan排斥不仅能进入抑制柱树脂颗粒之间的间隙体积也能进入树脂微孔内随着抑制柱的Na+H+界面不断向下移动NO2进入树脂微孔的程度不断改变因此得不到好的再现性甚至无法进行定量分析解决的办法是减少树脂的微孔高离子交换容量树脂的微孔体积与交联度成反比因此可以通过增加抑制柱树脂的交联度来缩小微孔但另一方面弱电解质在树脂微孔的吸附也与树脂的交联度成正比因此对抑制柱树脂交联度的选择只能用一个折衷方案(一般为8%12%)
填充抑制柱在今天的离子色谱上已经基本不采用但美国Alttech公司将填充抑制柱改进将其抑制柱中加入指示剂使抑制柱可以通过颜色的改变指示其再生情况而再生时采用电化学方法进行从而实现自动再生而更新的DSPlus抑制器在抑制柱后加入脱气装置淋洗液经化学抑制后去除CO2进一步降低背景电导值可以提高弱电离物质的灵敏度和实现碳酸盐梯度淋洗
2.纤维抑制器
纤维抑制器是一种新型抑制柱其功能与树脂填充的抑制柱相同但通过离子交换纤维膜来进行抑制反应如图4.6所示
图4.6纤维抑制器
这种纤维抑制柱是由一根纤维管绕在一个圆柱轴上制成纤维膜管内填充惰性小珠以减小死体积和增加流动相离子与管壁的接触对阴离子分离推荐的再生液是硫酸或磺酸对阳离子分离再生液是Ba(OH)2用重力或气体压力将再生液导入抑制柱
对阴离子纤维膜抑制器透过膜壁所发生的反应纤维管本身是一种离子交换膜具有磺酸(R-SO-3)阳离子交换基团当淋洗液(NaHCO3)通过纤维管时阳离子Na+被库仑力吸引到管壁的离子SO-3基上同时再生液(H2SO4)中的质子H+也被吸引并通过下述反应不断消耗H+使H+透过膜的扩散不断进行
由于H2CO3是很弱的酸反应趋向于生成H2CO3为了保持离子平衡Na+离子就会不断扩散进入流动的再生液中这种纤维膜类似一个半透膜只允许阳离子通过不允许阴离子通过在纤维管壁的反应可分为3个区
(1)淋洗液进入总消耗区
(2)抑制反应发生的动态平衡区
(3)总再生区淋洗液流出
平衡一建立只要有关的参数不改变就会保持动力学平衡由于能保持动态平衡与树脂填充的抑制柱比较纤维膜抑制器有下述优点
(1)工作时纤维管的外部一直是浸在新鲜的再生液中可自动连续再生不需要像树脂填充抑制柱那样每天用一定时间进行再生
(2)无填充抑制柱的Donnan排斥现象填充抑制柱在工作时柱内H+型树脂逐渐转变成Na+型使H+型的量不断减少Na+型的量逐渐增加而纤维抑制器中H+型和Na+型的量处在动态平衡状态这样对分析如NO2之类的弱酸根离子可得到比用填充抑制柱时更好的峰形和再现性而且提高了灵敏度
(3)当填充抑制柱逐渐消耗时水负峰的保留时间逐渐变长这就造成对F-Cl-和NO-2定量分析的困难当用纤维膜抑制器时水峰在F-峰前出现使Cl-的定量不受影响由于纤维膜抑制器存在动力学平衡负峰的保留时间恒定不变而且在定量计算时易于选择积分参数
(4)当用纤维膜抑制器时所有阴离子的灵敏度均得到提高这主要是由于纤维膜抑制器的体积小减少了柱外效应和对谱带的扩散作用
用纤维膜抑制器时背景电导取决于淋洗液和再生液的组成和流速淋洗液的浓度较低时背景电导也较低淋洗液浓度相同时流速增加背景电导也增加当淋洗液的浓度较高时可通过增加再生液的浓度或流速来得到较低的背景但不能超过纤维膜抑制器的容量如果淋洗液浓度比较高就可能很快地使纤维抑制器的容量完全消耗此时可用更浓的再生液但若再生液的浓度太高硫酸根离子就可能穿透半透膜这是由于Donnan排斥力不能阻止高浓度的硫酸根离子透过为此可用相对分子质量较大的磺酸衍生物如十二烷基苯磺酸作再生液这种大分子不会从半透膜上漏过去可以使用较高的浓度
阳离子纤维管抑制器的结构和工作原理与阴离子纤维抑制柱相似纤维管含有进行阴离子交换的季铵基(N+R4)工作时管内淋洗液(HCl)中阴离子Cl-被管壁上的N+R4基吸引管外再生液Ba(OH)2中的OH-也被N+R4基吸引并透过管壁进入内部与淋洗液中的H+结合生成水.
为了保持离子的平衡淋洗液中的Cl-离子透过膜进入再生液由此进行抑制反应即将高电导的HCl变成低电导的水同时将样品离子变成高电导的OH-型
用纤维膜抑制器时单位时间内再生液的总摩尔数必须是淋洗液的2倍以上这可以通过增加再生液的流量或浓度来达到但当选择再生离子浓度时还必须考虑来自纤维膜上离子的不完全Donnan排斥当再生液平衡离子的大小和电荷数最大时再生液平衡离子受到的Donnan排斥力最大在阴离子纤维膜抑制器中用H2SO4作再生液较用HCl好这是因为SO2-4为二价而Cl-为一价当再生液的浓度增加时为了避免再生液平衡离子透过纤维膜一般采用较大分子的再生液平衡离子为好因此若淋洗液浓度较高时在阴离子抑制柱中用甲苯磺酸或烷基苯磺酸阳离子抑制柱中用氢氧化四甲基铵3.平板微膜抑制器
纤维抑制器的出现克服了填充抑制器的缺点但仍受淋洗液的强度和性质的限制同时也不能进行梯度淋洗死体积比较大经过改进成为平板微膜抑制器它同时具有树脂填充抑制器的高容量和纤维膜抑制柱能自动连续再生以及保持动态平衡的优点图4.7为平板微膜抑制器示意图。
与一般抑制反应相同平板微膜抑制器的抑制作用也是通过酸碱中和反应淋洗液一般为弱酸的钠盐其pKa应大于5再生液通常是无机酸如硫酸由于抑制器的洗脱液一般接近中性即pH67淋洗液的pKa越大在洗脱液中它的离子型与质化酸型的比值越小洗脱液的背景电导越低一个最好的例子是NaOH它是弱酸(水)的钠盐pKa=14抑制器的作用是使淋洗液中的Na+离子与再生液中的H+离子完全反应由Na型转化为H+,由此完成中和反应
微膜抑制器完成抑制反应的方式与纤维膜抑制器相同淋洗液中的Na+离子通过强酸型阳离子交换膜与再生液中的H+离子交换与填充抑制器的树脂比较膜的离子交换容量很低这种膜具有对阳离子的可透性并同时具有对阴离子的排斥性从而为膜两边以相反方向流过的淋洗液和再生液之间提供了一个桥或门消耗H+离子形成弱酸的中和反应对H+离子直接提供了一个推动力使这些H+离子脱离再生液通过膜进入淋洗液流动相以中和弱酸淋洗液为了保持淋洗液膜和再生液的电中性等化学计量的Na+离子向反方向流动即淋洗液到再生液最后Na+离子被反相流动的再生液带入废液
抑制容量是单位时间中和的淋洗液摩尔数纤维抑制器的动态容量受到淋洗液离子从淋洗液流动相到膜的扩散的限制微膜抑制器克服了这个缺点因为微膜抑制器的淋洗液和再生液室中各有一个高容量离子交换网屏淋洗液从淋洗液室的一端进入沿网屏的长度方向通过网屏从另一端出去再生液的流路与此相似但方向相反拧紧外面的紧固螺丝使网屏和膜之间紧密接触以免发生层流现象
网屏以两种方式将流路中的Na+离子移至膜上其一网屏的三度空间结构可有效地将淋洗液流分散并引导其与邻近的膜接触其二网屏上的离子交换位置对Na+离子提供了一个向膜移动的连续通道网屏的机械结构和离子交换功能结合起来就大大地减少了动态容量对淋洗液离子到膜的扩散的依赖关系
第二个再生液室明显增加抑制器容量这是由于它使膜的表面面积增加了一倍而且在淋洗液室的两边都存在H+离子源减少了扩散增加了单位时间能中和的淋洗液离子的量
微膜抑制器的突出优点是死体积非常小(小于50L)和抑制容量高因此可用较强的淋洗液在进行高灵敏度分析时能得到稳定的基线
阳离子与阴离子微膜抑制器的结构相同其不同之处只是前者用阴离子交换网屏和总体功能基的阴离子交换膜而后者是采用阳离子交换网屏和总体功能基的阳离子交换膜
由于微膜抑制器是抑制容量高达40000S电导的淋洗液可适用于进行梯度淋洗
4.电化学抑制器
电化学方法对离子色谱中的电导进行抑制是厦门大学田昭武等人最早提出并商品化的它采用电解水产生H+和OH-使电解产生的H+和OH-透过阳离子或阴离子交换膜使淋洗液的Na+或Cl-与之发生交换进行电导抑制其结构类似于平板膜抑制器由于国内的膜技术相对落后等各方面原因厦大生产的电化学抑制器在使用前要通入一些硫酸或氢氧化物再进行抑制但它不必采用连续再生因此它实际上是电化学和化学抑制法的组合
美国Dionex公司将这一电化学抑制法进行改进在它的平板微膜抑制器生产的基础上设计了电化学自再生抑制器其结构示意如图4.8所示。
图4.8 电化学自再生抑制器示意图及连接方式
其工作原理与平板微膜抑制器相同所不同的是它的H+源或OH-不是通过连续再生液得到的，
而是通过水的电解产生其水源可以外接蒸馏水也可以是检测器流出的淋洗液图4.8(a)为采用环循方式进行自再生(b)为采用外接水源方式进行自再生一般外接水源方式在淋洗液含有有机溶剂时采用
三离子排斥色谱中的抑制
对阴离子的离子排斥淋洗液的抑制最早是利用盐酸(淋洗液)和银型树脂之间的沉淀反应.此反应中Ag+与Cl生成AgCl沉淀为了保持树脂的电荷平衡淋洗液中的H+进入树脂的交换位置这样就从淋洗液中完全除去了HCl样品离子An-在抑制柱中通过下述反应转变成银型抑制柱之后,加一个H+型的后置抑制柱将样品阴离子从银型转变成酸型
因为只有样品阴离子进入后置抑制柱所以此柱的消耗(即树脂从H+型转变成Ag+型)速度很慢一般使用一个月之后需要再生由于这种抑制反应是一种沉淀反应理论上可用浓NH4OH再生但需要很长时间无实用意义此外随着AgCl沉淀的增加抑制柱的压力逐渐上升可观察到明显的扩大的AgCl沉淀带必须用峰面积计算才能得到准确的结果后来发展了一种适合于阴离子排斥的纤维抑制柱其纤维是一种磺酸型离子交换膜结构与一般纤维抑制柱相同淋洗液在纤维管内流动再生液在纤维管外与淋洗液相反的方向流动用烷基磺酸盐作淋洗用氢氧化四丁基铵(TBA)为再生液再生液中的TBA+与淋洗液中的H+交换再生液中的OH-与淋洗液中的H+结合生成水从而降低了H+的高背景电导RSO-3TBA+离子对的电导比RSO3H+低很多可得到很低的背景电导
这种抑制方式还可以在平板微膜型离子排斥抑制器中实现但目前还没有电化学自再生型的离子排斥抑制器
四流动相离子对色谱的抑制
流动相离子对色谱与普通离子对色谱的主要区别在于它用化学抑制型电导检测器抑制器的作用是从淋洗液中除去离子对试剂同时将待测离子转变为对应的酸型或碱型例如在阴离子流动相离子对色谱中在H+型抑制柱发生两个重要反应
(1)离子对试剂(R4N+OH-)中的阳离子(R4N+)被除去OH-离子对被树脂的H+离子中和成水.
(2)转变样品离子A-成对应的酸.
五抑制电导检测的种类
电导检测是检测进入检测池的离子包括有机和无机离子最适用于强酸碱的阴阳离子例如SO2-4Cl-Na+K+三氯乙酸等当检测弱酸碱的离子时检测的灵敏度主要取决于它们的pK值
1.阴离子
pKa3时检测灵敏度最高pKa在37之间灵敏度比较低信噪比下降pKa7时的阴离子在某种条件下可以被检出这是由于随着pKa的增大电离度减少使背景电导值与被测离子电导值相似因此有机酸羟基化合物磺化物磷化物等官能团的pKa4.75可以采用电导检测而检测普通的无机强酸阴离子如Cl-NO3-SO2-4PO3-4电导检测是最理想的
2.阳离子
无机阳离子的检测包括碱金属和碱土金属而过渡金属离子由于水解或在抑制器中产生沉淀不易检出过渡金属离子通常在加入螯合剂发生柱后反应时进行可见波长的检测几乎全部有机阳离子都是胺类脂肪胺的pKa7易被检出但芳香胺和杂环胺的pKa值在27之间一般保留很强采用阳离子交换时加入有机改进剂从而使电导检测的噪声增大因此不适宜于抑制型电导检测虽然非抑制型电导检测可以分离检测但灵敏度很低通常应使用紫外或直流积分脉冲安培检测
3.两性离子
两性离子不宜通过抑制电导检测它们一般包含阴阳离子的官能团(例如氨基酸带有氨基和羧基)在通过抑制器时将改变形态以致于不能到达检测器非抑制型电导检测时特定pH值的流动相可以使分子保持电荷而被检出大部分包含胺基的两性分子最好使用脉冲积分安培检测而紫外检测可以用于芳香胺族的两性分子的检测
六电导检测的流动相
选择流动相时必须考虑到分离和检测方法为了保证最佳的分离效果流动相的淋洗强度分离效率是主要依据对于电导检测而言一个好的流动相与目标离子的电导响应值和背景的大小相联系
流动相一律是由水和强电解质组成如果使用有机溶剂兼容的柱子(如OmniPac或MPIC)就可以使用典型的反相溶剂(甲醇或乙腈)有机溶剂是离子对流动相的重要成分并可在离子交换分离中控制灵敏度由于有机溶剂不导电也就不会干扰电导检测
1.阴离子交换分离
使用抑制器时流动相的离子化成分在抑制器中转化为弱电导成分使用弱酸的钠盐是因为它们在抑制器中被转化成为近中性的酸酸的pKa值越高其背景电导就越低使用pKa5的弱酸可以进行等浓度的淋洗然而进行梯度淋洗时pKa应大于8这样可使基线漂移减至最小
NaOH溶液是用于阴离子交换的一种很好的淋洗液因为OH-在抑制器中被中和成水它更多地用在梯度淋洗中另一种常见的流动相是Na2CO3NaHCO3缓冲溶液它被抑制为碳酸(pKa=6.2)其背景电导值约为1020S可适用于等浓度淋洗但不适用于梯度淋洗
其他用于抑制型阴离子交换色谱的流动相还有硼酸的钠盐(pKa=9.2)和对氰酚(pKa=8.0)硼酸盐是弱电离的水合无机酸由于它的pKa值大抑制后的背景电导很低对梯度淋洗很有用对氰酚具有疏水性的一元取代基用于淋洗强保留的疏水性一价阴离子如I-SCN-等在非抑制型阴离子中流动相中离子成分的电导与目标离子的电导不同应使用苯甲酸盐和邻苯二甲酸盐这些大分子低摩尔电导的物质作淋洗液葡萄糖酸盐硼酸盐溶液也具有低的背景电导值在进行高浓度分析时灵敏度和基线噪音应在可以接受的程度之内
2.阳离子交换分离
稀强酸经常与有机溶剂混合作为分离碱金属和碱土金属的淋洗液配备自再生阳离子抑制器可以使用甲磺酸使用甲磺酸乙腈进行梯度淋洗一次进样可以分离多种胺类和无机阳离子
某些分离柱需要一种比H+更强的取代离子淋洗保留性比碱土金属还强的离子这就需要将23二氨基丙酸(DAP)与强酸混合后使其质子化
对阳离子非抑制型离子色谱而言最好的流动相是稀释的强酸(1mmolL
HNO3),但其背景电导值很高(1mS)以至于信噪比不足以检测低浓度离子既然H+的电导高于其他阳离子因此洗脱被测离子时电导值降低所以分离过程出现负峰
3.离子对
用于离子对色谱的流动相通常由水有机溶剂和疏水性离子对试剂组成分离阴离子使用四元胺的钠盐分离阳离子使用长链的磺酸盐对于抑制型电导检测这些试剂可以提供离子对OH-(阴离子对)和H+(阳离子对)
4.3吸光光度检测
离子色谱用的吸光光度检测器主要有紫外和可见光光度检测器它们也是高效液相色谱中用得最早而又广泛使用的检测器目前离子色谱采用吸光光度检测其原理几乎与现有的高效液相色谱所配置的吸光光度的检测器完全相同它不仅有高的选择性和灵敏度而且对环境温度流速波动淋洗液组成的变化不敏感因此无论等浓度淋洗还是梯度淋洗都可采用对强吸收物质的检测下限可达1ng
一.吸光光度检测原理
吸光光度检测器是通过测定物质在流动池中吸收紫外光的大小来确定其含量的对于单色光物质在流动池中的吸收服从Beer定律.对于给定的池体积在固定的波长下待测物的吸光度与其浓度成正比二吸光光度检测器结构
吸光光度检测器可分为单波长多波长及连续波长检测器由于技术的不断改进目前均采用连续波长检测器其结构如图4.9所示。
图4.9吸光光度检测器光路图
(1)光源在紫外区工作(190400nm)时采用氘灯在可见区工作(350800nm)时采用钨灯
(2)单色器设定光栅的不同角度实现波长的选择半透半反镜把光线分成两束一束进入检测器另一束作为参比信号
(3)检测池由测量池和参比池组成为了减少色谱峰的扩展测量池通常小于10L池内径约1mm光路长度约10mm
(4)接收元件可以是光电倍增管光电管或光敏电阻其相应的电子线路也有多种形式采用光敏电阻作接收元素测量线路是普通的惠斯登电桥采用光电管或光电倍增管时测量线路是微电流放大器
三吸光光度检测器的应用
吸光光度检测器可以测定大量的有机物许多无机离子有紫外吸收也可以直接进行测定除了直接测定吸光光度检测器还可以用于柱后衍生间接检测法对大量无光度吸收物质分析
一般都选择对欲分析物有最大吸收波长进行检测以获得最大的灵敏度和抗干扰能力测定波长的选择取决于待测物的成分和分子结构分子中光吸收性强的基团叫发色基团它与分子的外层电子或价电子有关不论是普通高效液相色谱还是离子色谱流动相的组成影响它的紫外检测的最小波长界限一般来说离子色谱的淋洗液是盐类化合物如Na2CO3NaOH或HCl混合物的水溶液它们可能含有乙腈或甲醇乙烷磺酸和氢氧化四丁基铵等有机物
四柱后反应衍生法
多数无机离子和氨基酸一类有机离子没有紫外吸收不能直接用光度检测器检测若在分离柱后连续地加入显色剂使这些离子生成带有发色基团的衍生物即可用光度法来检测这种方法称为柱后反应衍生检测法此法已广泛用于分析重金属离子氨基酸多元胺多聚磷酸盐和EDTA等是一种十分有效的检测手段图4.10所示为一种柱后衍生检测的分析流程图
图4.10柱后衍生检测示意柱后反应器装在分离柱出口和检测器之间分离柱流出液与显色剂在一个特制的三通内混合三通应具有小的死体积并能确保两种溶液充分混合显色剂可以用一专用泵输送也可以将它盛在加压气罐内用氮气压出混合液再流经由螺旋管组成的反应器进行反应生成的带发色基团的衍生物进入光度检测器内检测螺旋管的长度由衍生物生成时间来决定为了减少色谱峰的柱后扩散螺旋管的内径应在0.5mm以下或采用内径1mm填充有0.6mm惰性微球的塑料管必要时可将反应管加热以促进反应的进行
Dionex公司将一根可渗透试剂的特殊空心纤维管绕在柱后衍生器的轴上其结构与纤维抑制器相似由分离柱流出的洗脱液在纤维管内从上往下流动柱后反应试剂在管外管壁允许试剂渗透进去由于管外充满了在一定压力下的可渗透入管内的试剂溶液使在管内流动的洗脱液不能渗漏到管外而试剂不断地被加到纤维管内的洗脱液中这种加入试剂的方法比混合池均匀而且由于纤维管细而长新的试剂连续地加入试剂与样品离子之间的接触比直接混合更有效不仅增加了反应速度而且使反应更完全
柱后反应检测技术的应用增加了检测器的选择性和灵敏度应用此法对显色剂的选择十分重要选择时应遵循以下原则
1.发色反应最好在2min内完成以获得良好的重现性
2.显色剂的使用应充分过量并用高浓度的缓冲溶液配制以维持恒定的pH值保证反应进行得快速完全3.显色剂的加入体积应为淋洗液的10%15%以减少其稀释作用
4.在检测条件下试剂本底吸光度应保持在最低限度
5.试剂能在长时间内保持很好的稳定性
另外柱后反应衍生法还可以用于氨基酸和一些生物活性胺分析中用柱后反应衍生检测法将试样分子中的伯胺基团与邻苯二醛反应生成荧光活性衍生物然后用荧光光度检测器检测由于大多数无机金属离子在紫外光谱区吸收弱特别是过渡金属离子由于两性离子或沉淀无法用抑制电导检测而电化学检测选择性较高只适用于个别的金属离子因此柱后衍生紫外吸收检测法应运而生该法特别适合于高价金属离子过渡金属离子和镧系金属离子等的检测
最常用的金属离子衍生试剂是4-(2吡啶偶氮)间苯二酚(PAR)将1mmol的PAR溶解在pH值较高的缓冲溶液(如NH3NH4Ac)PAR可以与大多数过渡金属离子(包括镧系)形成络合物在520nm处检测
此外还有其他一些金属离子如45-二羟基间苯二磺酸衍生测定铝离子15-二苯基碳酰肼衍生测定铬()离子钼酸盐衍生测定硅酸盐和磷酸盐等
对于氨基酸分析柱后衍生试剂可以采用茚三酮在130的温度条件下检测在570nm下有最大吸收并加以测定同样茚三酮也可以用于检测蛋白质和多肽等化合物
五.间接检测法
间接检测法就是在流动相中加入适量的有检测响应的物质以检测无响应的被测定化合物的分析方法这种方法在技术和操作上比较简便间接检测方法的基本原理很简单在液相色谱流动相中加入一个具有可检测响应信号的与固定相有一定亲合力的物质通常称之为探针试剂注入的被分离样品由于对可检测的探针试剂的二相分配过程的影响导致检测器对被分离物质的间接信号响应
间接检测法主要用于光度检测器如紫外吸收检测器和少数荧光检测器以测定无紫外吸收的样品它同样也用于单柱型阳离子电导检测在一些抑制电导检测和安培检测中采用这种方法可以大大扩展离子色谱的应用范围
以紫外吸收检测为例我们对其检测原理进行讨论紫外吸收检测器能直接检测具有紫外吸收的有机离子部分无机和有机离子在低波长紫外区有吸收也能直接检测而大部分无机离子和一些有机离子紫外吸收低要采用紫外吸收检测时只能采用化学衍生或间接光度法测定
一般在离子对色谱光度检测中被测离子带有发色基团在流动相中加入无色基团的反离子形成离子对被检测而在间接光度离子对色谱法中流动相中加入的是带发色基团的反离子形成了高的紫外吸收本底当注入无紫外吸收的被测离子时被测离子与反离子以静电力结合在一起形成离子对在键合相与含水流动相之间进行分配而被分离由被测离子引起反离子基流的变化而产生了检测信号的变化这种紫外吸收试剂又称为离子对探针而这种形式的离子对可以认为是一种特殊的衍生化形式
为了实现间接光度法检测洗脱液要满足一些化学上或光度测量上的要求通常使用低浓度的洗脱液有利于灵敏度的提高要获得精确的测量吸光度值应在0.20.8范围内当固定相和流动相都确定后最佳吸光度范围可借助于调整检测器的工作波长来实现间接光度检测的灵敏度通常高于一般的电导检测器其最低检出浓度低于10-6gmL
在间接光度检测中有两类色谱峰一类是流动相本身组分产生的系统峰另一类则为样品峰这两类峰的出峰方向比较复杂尤其是在离子对色谱系统中对此必须特别注意
间接光度检测法除了可以用于常规的阴离子检测外还可以用于含芳香基的胺类及季铵盐芳香基磺酸盐金属络离子的检测
4.4电化学检测
电化学检测器(electrochemical detector,ECD)是根据电化学原理和物质的电化学性质进行检测的从广义上讲电化学检测器包括安培极谱库仑电导电压电容等类型其中安培极谱库仑检测器以测量电解电流的大小为基础统称为伏安检测器其中安培检测器在离子色谱中的应用最为广泛因此一般在离子色谱中所讲的电化学检测器是指安培检测器
一安培检测器的工作原理
安培检测器是由恒电位器和三电极电化学池组成这3个电极是工作电极参比电极和对电极在工作电极与参比电极(AgAgCl)之间加一个产生氧化或还原反应的工作电位也称施加电位(Eapp)电极的材料通常为玻碳金银或铂用以确保施加电位的恒定并阻止电流通过参比电极以避免参比电极的漂移
在电化学池中所产生的电流是溶液中的分子在工作电极表面被氧化或还原而产生的氧化反应时电子从电活性组分的分子转移到工作电极上产生正的电流或称为阳极电流还原反应时电子从工作电极转移到电活性分子上产生负的电流或称阴极电流在电化学池中Eapp的大小和极性决定是否能发生电化学反应适宜的施加电位应使被测组分发生氧化或还原反应而淋洗液及样品中其他组分不发生氧化或还原反应1.基本工作原理
假设由工作电极和参比电极组成的电解池中有被测组分A在工作电极和参比电极逐渐改变外加电压组分A在阳极表面上发生反应.
2.扩散电流
在一定的实验条件下E12值与待测分子的浓度无关仅决定于待测分子的本性对带有电化学检测器的高效液相色谱除了用保留时间定性鉴别被分离的组分外还可以利用被测组分的电化学伏安特性进一步确定具体的做法是可以比较被测物质和标准样品的伏安特性曲线的形状半波电位或不同电极电位下的电流响应比值等
伏安法是选择施加电位Eapp常用的方法在一电化学池内在很大范围内改变施加电位同时测量由电化学反应产生的电流作出施加电位对电流的关系曲线即得伏安图可以用来确定安培检测法的最佳施加电位值
两种主要的安培检测形式(直流积分检测)测量分析离子在工作电极表面发生氧化还原反应所产生的电流或电荷在氧化反应中电荷从样品离子移向安培池中的工作电极在还原反应中电荷从工作电极移向分析离子对于可以被氧化或还原的目标离子可能存在的干扰物质不会被氧化还原因此检测非常灵敏且选择性高当一个持续不变的电位施加于工作电极时检测模式为直流安培电位多次变化且重复时的检测模式为积分脉冲安培
二电化学检测器结构
1.电化学检测器结构
安培检测器的性能取决于多方面的因素设计性能良好的检测器需要考虑电极反应的程度电极反应的程度决定于试样的浓度外加电压两电极材料和色谱洗脱液的物理化学特性检测器具体设计主要考虑以下几个方面电极材料检测池流体动力学条件和测量技术
常用的伏安检测器由1个恒电位器和3个电极组成的电化学池构成恒电位器可在工作电极和参比电极之间提供一个可任意选择的电位使输出电位保持恒定它不受电流变化的影响减少了参比电位漂移提高了检测器的稳定性
安培检测器检测池如图4.12所示常用的有薄层式和管式池
图4.12 安培检测器结构A.薄层式B.管式
(1)薄层式检测池
薄层式检测池是最常用的安培检测器常简称为薄层池它的检测范围为10-910-12molL检测下限低线性响应范围广重现性良好
检测池由两块特种塑料板之间压着一层中心挖空的聚四氟乙烯薄膜垫片组成薄层池的容积由夹在中间的薄膜垫片的形状和厚度决定(膜厚度一般为50150m,容积一般为510L)薄层通道的容积过小会影响灵敏度容积太大会使已经分离的色谱组分混合影响分离效果在电极良好抛光的条件下通过减少液层厚度和增大流速来提高灵敏度以测量极小体积的样品(2)管式检测器管式工作电极易于制造工作电极与参比电极由离子交换膜隔开检测池的灵敏度由管式电极和池体积决定受检测池的构型影响较小其检测池的测量下限可达10-8molL但其微型化及清洗等受到限制
2.工作电极
一般离子色谱用的电化学检测可以采用四种不同材料的工作电极金银铂玻碳
选择工作电极的依据有以下4点
(1)电位极限
负电位的极限是流动相或电解质还原时的电位正电位的极限是流动相电解质或电极自身被氧化的电位由于这些反应所产生的电流远远大于分析离子氧化还原反应所产生的电流所以用于检测分析离子的电位必须小于上述极限电位极限受流动相的pH值影响很大负电位极限在碱中更正相反正电位极限在酸中更正在碱中更负换句话说可使用电位在酸溶液中变正在碱溶液中变负
当所施加电压接近极限电位时噪声也就是背景电流增加此时对于金属电极背景电流急剧增加对于玻碳电极背景电流缓慢增加因为可使用的最大施加电位要通过检测所需信噪比而得到.
使用玻碳和铂电极可以得到正电位极限的最大值适于进行氧化反应使用玻碳金银电极可以得到负电位极限最大值因为在铂电极表面H+将被还原为H2所以铂电极具有很低负电位极限且一般不用于还原反应
使用AgAgCl参比电极时负电位可以接近-0.1V流动相中分子氧化物的分解将造成高背景电流稀释流动相可以大幅度降低背景电流
(2)电极对氧化还原反应的影响
氧化反应机理是研究被测离子在电极上发生氧化的过程电极作为惰性的电荷吸收点本身不参与氧化反应这种反应原理决定了石墨是最佳的电极材料例如儿茶酚胺和芳香胺的检测
金电极和铂电极在与被测物形成络合物或沉淀时电极易被氧化因此在检测这些被测离子时工作电极的材料将发生反应而损耗如铂电极在氰化物测定过程中其电位比氰化物在其他电极上直接氧化成氰酸要低得多使用较低的施加电位可以增加分析的选择性被氧化的成分也越少而且低电位下流动相中痕量杂质氧化产生电流的噪声也将下降
银电极也用于检测与其易络合或易沉淀的离子的测定例如它在Br-I-HS-SO2-3S2O2-3硫醇等物质的测定上
(3)电荷转移反应的动力学
由于电位在E0时电荷转移反应进行很快Nernst方程中描述了分析离子中氧化与还原的比例这是可逆的如果Eapp-E0=0.118V那么电极表面分析离子中氧化物与还原物的比例是1001几乎到达电极表面的分析离子全被氧化但只能得到有限的电流增强施加电位也无济于事反之还原反应是不可逆的且在E0时电荷转移反应的速率很慢这就需要施加一个高于E0的电位以加快反应的速率这个电位叫做过电位越不可逆的反应过电位越大这会造成噪声增加和选择性下降许多物质的氧化还原反应在特殊电极上比其他电极更易于发生对于无机小分子在铂电极上比玻碳电极更易于氧化还原反应例如铂电极用于检测亚砷酸盐I-HS-
(4)电极的长期稳定性
选择电极材料时一个主要考虑的问题就是如何维持其表面活性在正向施加电位下电极表面会产生氧化层它将阻止分析离子的氧化造成重复进样时响应值降低抛光电极可以恢复电极活性玻碳电极比金属电极在阻止生成氧化层方面更具有优势且不需要经常抛光这就是在直流安培中它的应用比金属电极广泛的原因积分脉冲安培使用金铂电极时要施加很高的正负电位以清洗电极
3.参比电极和对电极
通常用AgAgCl或饱和甘汞电极作为参比电极金铂或玻璃碳电极作为对电极参比电极对电极应放在工作电极的下游这样对电极的反应产物和参比电极的渗漏等不会干扰工作电极对电极又称辅助电极补偿电极一般置于池的出口处并尽可能地靠近工作电极构成电化学反应中的回路连接色谱柱到检测池的不锈钢毛细管有时可用作对电极甚至以惰性材料建造的池体自身也可以充当对电极以抵偿电阻确保施加电压的恒定并阻止产生大电流通过参比电极减少电位漂移和提高检测的重现性参比电极作为反馈溶液和电位信息的探针随时与设定的施加电压进行比较使电压跟随器和受控放大器互成恒电位器工作电极保持在有效接地状态因此在测量过程中即使施加电位改变其对地电位也相对稳定三电化学检测器的类型
离子色谱采用安培检测器主要分为两种类型直接安培检测器和脉冲安培检测器直接安培检测采用恒定施加电压对被测物质进行测定这类检测可以测定卤素类卤素S2-酚类醌类胺类等化合物
脉冲安培检测器一般用于糖类氨基酸醇类等物质的分析这些物质在贵金属电极上被施加恒定电压下会产生沉积使测定的重复性不好灵敏度降低因此测定时在这类检测器施加一个电压随后在这个电压后施加一个比较高或比较低的电压对电极检测之后进行清洗使安培检测器可以灵敏重现地进行检测
1.伏安法
安培检测所需的最佳电位源于一个电化学技术名词伏安法此项技术通过使含有目标离子和电解质的溶液流经工作电极而实现它可以在一个具有旋转圆盘形的工作电极的烧杯形流动池中建立起来也就是目标离子和流动相流经ED40的安培池时借助预先设置的施加电压可以测绘氧化还原反应所产生的电流溶液未流动并且设扫描电位先正后反起始电位等于终止电位此项技术称为循环伏安法在此模式下使用X-Y记录仪示波器计算机可以记录伏安图
2.直流安培
(1)选择施加电位
对于直流安培而言最佳检测电位对应于扩散限制电流在前面的例子中最佳电位是+0.6V继续施加电位只能增加噪声还将降低选择性通过施加一系列电位得到不同的峰高可以很容易的确定最佳电位使用直流安培多次进样并在每次进样后增加电位所得到的结果见图4.13由此得出最佳施加电位为0.7V。
被测物氧化还原反应所产生的电流与以下因素有关如被测离子的浓度测定的温度工作电极的表面积流经工作电极的溶液速度等另外还要保证安培池设计具有最大的线性流速和信噪比
(2)直流安培检测
直流安培检测应用于含有酚基和儿茶酚的分子(主要是医药和生化分析)最重要的应用是检测儿茶酚胺(如尿和血浆中的肾上腺素多巴胺等)
含有酚基官能团的止痛药易被检出酪氨酸也含有酚基官能团不仅这种氨基酸能被检测含有酪氨酸的多肽也能被检测其他可以被检测的有机物质有芳香胺硫醇硫醚磺胺类抗生素除了芳香胺还可以检测另外一些无机物质结构复杂的无机阴离子例如HS-CN-I-也可以使用银电极进行检测
3.脉冲安培
脉冲安培检测的发展源于糖的检测由于大部分糖类不含有UV发色团所以UV光度检测只能使用很低的波长但是在210nm时对糖的检测既不灵敏选择性也差折光指数检测也是这种情况脉冲安培检测不仅取代了这些光学方法还能检测含有羟基胺基醛基巯基等官能团的不具有发色团的分子
虽然糖在金铂电极上被氧化但会产生污染电极表面的物质阻止进一步分析高低电位之间的重复脉冲可以使电极表面保持稳定和清洁使用金电极的脉冲安培检测对于相对分子质量1万左右的糖是一种重复性好且灵敏的方法
糖类能在强碱溶液中(pH11)被脉冲安培检测它们均是pKa在12左右的弱酸易被高效阴离子柱分离流动相一般是11pH14淋洗寡糖和多糖时一般加入乙酸钠以增加流动相强度所以阴离子交换分离与脉冲安培检测相结合是测定糖类的一种强有力手段尽管有来自胺基和巯基的干扰它仍然具有很高的灵敏度和选择性
(1)脉冲安培的原理
为了了解脉冲安培的原理首先应该使用常规的电化学技术(例如伏安法)研究分析离子的氧化还原反应下面的例子是使用金电极AgAgCl参比电极和0.1
mmolL NaOH检测葡萄糖的循环伏安图(见图4.14)
图4.14循环伏安图
图中的虚线表示不含糖类的0.1mmolL NaOH电解时的电流也就是背景电流它从-0.80.25
V呈缓慢上升趋势说明金电极表面开始发生氧化反应至0.6
V时施加反应电位金的氧化物被还原为金其负峰电流在0.1
V处
溶液中加入糖后电流仍然在0.8V处缓慢增加在糖发生氧化反应前曲线无显著变化但在-0.15V处开始明显变大在0.25V处达到峰值后开始下降这里有两个原因一个是电极表面糖的浓度由于其大部分已被氧化而降低二是金电极的氧化也阻止了糖氧化的继续行反之金电极氧化后在开始还原时电流下降在金的氧化物还原为金时糖的氧化又开始了如果使用直流安培检测适当的施加电位应是0.2V此时糖的氧化电流最高而背景电流最低然而使用单电位将在电极表面形成氧化层而导致灵敏度下降解决的办法就是首先测量在0.25V的糖氧化峰值电流然后使电位跃升至一个较高的值以促成金电极的氧化再回到使金氧化物发生还原反应的负电位重复此举可以清除电极表面的氧化层使电极表面稳定无污染由此得出糖检测的三段波形图图415为典型的三电位脉冲安培波形图
图4.15三电位脉冲安培波形
施加的电位及其持续时间分别为E1E2E3t1t2t3(E为0.1V低于0.25V的背景电流金电极在0.2V开始氧化时的背景电流具有最小噪声并对参比电极电位可以提供一个安全界限)通过设置的时间和积分电流测量E1时的信号设置时间的积分电流以电荷表示单位是库仑从E3至E1的步骤是从-0.1~+0.1V也就是电极溶液两界面之间的电容充电过程
糖的氧化电流被积分时允许衰减的充电电流滞后类似的3段电位波形还可以检测醇类和醛类(2)波形参数的优化
为了得到用于脉冲安培检测的最佳电位和时间应从基本波形出发再优化其参数通过伏安图或相似成分的检测参数就可以选择基本波形
首先选择E1电位使分析离子的氧化电流对于背景电流具有最大比例t1持续0.4s前0.2s是滞后时间后0.2s的积分时间具有良好初始值E2和E3的设置应该接近正负电位极限一般持续0.1s为了优化全部参数每个参数应独立变化以测定其对重复性信号大小基线水平和噪声的影响例如使用金电极检测糖时背景电流与滞后时间的关系如图4.16所示
图4.16电流滞后时间关系此坐标是通过积分时间进行重复测量而得出的从中看出0.2s的滞后时间可以充分地使充电电流衰减到零图4.17显示了使用金电极时峰高与滞后时间的关系。
图4.17峰高-滞后时间关系既然从00.25s响应值下降很小所以0.2s的滞后时间可以提供信号与背景之间的最佳比例对于E1,正或负清洗时间及电位在改变其数值后重新进样测量就可以得到类似的坐标清洗电位应该是最小绝对值的正或负电位用以产生最佳的检测响应值和重现响应值(重现响应值应通过真正的样品而不是标准溶液进行检查以确保样品中污染电极的成分不会干扰电极的清洗)为了使样品峰具有精确的重现性应使用尽可能短的完整波形以保证出峰速率所以最终的波形是这些因素妥协的结果例如积分时间增加一倍可以提高信噪比但也增加了整段波形的时间而使先洗脱的样品出峰重现性下降图415中的电位程序就是通过优化方法得出的
(3)脉冲安培检测
脉冲安培检测是一种检测糖的最具灵敏度和选择性的方法高pH的阴离子交换与脉冲安培检测配合使用正成为检测糖类的经典方法例如食品饮料生物制品中糖的检测脉冲安培还用于检测醇醛胺(一二三元胺包括氨基酸)有机硫硫醇硫醚但是硫的氧化物(例如硫酸盐磺酸盐砜)不能被检测
4.积分脉冲安培
积分脉冲安培检测是重复电位与时间波形的函数在某一波形中电流被积分它是比三电位脉冲安培检测更常见的技术能以任何波形出现此方法可以用于检测胺和硫化物这是因为金属电极的氧化对上述物质的氧化起催化作用而且积分安培的波形可使电极氧化对背景的影响降至最小降低pH值改变对信号影响允许进行适度的改变pH值的梯度淋洗而不致于造成基线有大的漂移脉冲安培中电流在一个脉冲之后的电位被积分图4.18是0.1mol/L
NaOH+亮氨酸的脉冲/积分循环伏安图。
图4.18 脉冲积分循环伏安图4.19是积分脉冲安培检测的波形示例当电位正向扫描时为金属氧化物生成的波形在反向扫描为氧化物还原的波形时电流被积分没有分析离子出现时电荷近似为零积分过后正负清洗脉冲时间波形加入电位使用类似脉冲安培的方法可以优化波形 |
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