分光光度计在光谱分析方法中是不可缺少的仪器。随着光谱分析法在各个领域中的应用越来越广泛，分光光度计的种类也越来越多。现今的分光光度计有紫外－可见分光光度计、红外分光光度计、原子吸收分光光度计、分光荧光计等等。而现行应用最为广泛的是紫外－可见分光光度计。下面主要介绍紫外－可见分光光度计。

当光线穿过某种化学溶液时，总要被吸收一部分，即出射光总要小于入射光。这二者之间的比值称作吸收值。就某一溶液来说，虽然对各种波长的光都有所吸收，但其吸收值是不一样的，有其特征的吸收峰，即对某一个（或几个）波段的光吸收特别强烈。并且其吸收率与溶液中该成分的浓度成一定关系。因此，根据溶液在全波段光扫描中的特征峰 ，可以判断溶液中的某些组分，达到定性的目的，或者用某一特定波段的光穿透样品，根据样品对光的吸收程度，确定该组分的浓度，达到定量的目的。这就是应用分光光度计的基本原理。

许多物质的吸收峰在可见光波段以内，由于有些生化物质如蛋白、核 酸等，其吸收波在紫外光波段内。因此有时用紫外和可见光发生器安装在一台仪器中供选择。即紫外－可见光分光光度计。

分光光度计按用途分二类：一类是用连续的波长对样品进行扫描，以测定其样品的光吸收特征曲线，如扫描式分光光度计；另一类是用某一特定波长对样品进行照射，测定样品的吸收值。(如常用的721型分光光度计)

也有的已专门化，如核酸－蛋白分析仪，即把入射光调整到核酸蛋白的最大吸收波段，专门用于生化分析蛋白或核 酸层析等用。

分光光度计结构及其原理

    2002.12.05    

    紫外－可见分光光度计由光源、分光系统(单色器)、吸光池、检测器及控制系统和记录显示系统五个部分组成。从结构上可分为下列三种：

1. 单光束分光光度计(图4-4)



图4-4 单光束分光光度计光学系统及结构示意图

光源(1) 发出的连续光由凹面镜(2) 及平面镜(3) 反射，集中于狭缝(4)，通过(4)聚集于准直镜(5)，再反射于石英棱镜(6)，复合光(混合光)遇棱镜喷涂铝的反射面而反射回来，为棱镜所色散，并形成连续光谱。再由准直镜(5)反射至狭缝选择所需波长(4)射入样品溶液吸光池(7)，透过的光入射到检测器的光电管(8)上，发生光电效应而产生光电流。再经放大，使电流计偏转，当吸光 池内装有溶液时，电流会变小，该值与空白时的电流值之比为吸光值。样品溶液的吸光度值与样品溶液组分的含量或溶液成正比。因此可测定待测组分的溶液或含量。这种分光光度计结构简单．价格低廉．操作方便．维修容易，适用于常规分析。

2. 双光束分光光度计(图4-5)



图4-5 双光束分光光度计结构示意图

双光束分光光度计的分光系统基本同单光束分光光度计，不同的是利用反射镜组(Ａ－Ａ与Ｂ－Ｂ)间的摆动，使单色光辐射交替地通过样品Ｓ和参比样品Ｒ。另外开关ＳＷ动作与反射镜组的摆动同步，把光电信号切换到相应的电子线路，被记录下来。提高了仪器的稳定性。精确度，并能自动记录吸收光谱。

3. 双波长分光光度计(图4-6)
图4-6 双波长分光光度计结构示意图
双波长分光光度计主要由光源 (1) 发射的光，经过双分光系统(单色器) (2) 得到所需要的两个不同波长的色光，波长?1和?2交替地由切光器 (3) 通过吸收池中的样品溶液 (4)，透过光的信号用光电倍增管检测器 (5) 接收。最后显示出两个波长下的吸光度差值 (△Ａ)。

分光光度计的安装和性能测试

    分光光度计是光学、精密机械和电子技术三者紧密结合而成的仪器。正确安装、使用和定期检查仪器的性能，加强维护和保养能保证从仪器获得准确的分析结果，延长仪器使用寿命和提高仪器使用效果。

1. 装置分光光度计实验室的基本要求

(1) 温度：装置中高档的分光光度计的实验室最好安装空调设备，使室温保持在 20℃±2℃，条件较差的实验室，最高温度也不宜超过28℃，最低不低于15℃。棱镜的折射率随温度而改变，因而温度的变化影响棱镜色散特性；也会影响光学零件的成像质量。

(2) 湿度：一般控制在45-65％，上限不超过70％。温度大容易使光学零件表面发霉生雾，特别严重时，水蒸气对1 359-1 450nm辐射产生吸收而干扰测定，潮湿气体易产生漏电流而影响光电转换元件的暗电流。

(3) 防尘：尘土对光学和电子系统都有不良的影响，如尘土散落在光学部件表面会增加仪器的杂散光和降低透光性和反射率。也会导致电子元件的旁路．短路或接触不良。因此应尽可能减少实验室的尘土污染。

(4) 防震和防电磁干扰：震动可导致棱镜和光栅的位移而产生波长的差，也使测量系统产生波动。外界的电磁场使仪器电子系统产生扰动，尤其影响光源灯稳定性导致整机电子系统工作不稳定。因而应尽可能远离振源和避免与用电量变化大的其它大型仪器共用电源。

(5) 防腐蚀：分光光度计工作室与化学操作室必须分开，避免化学操作室的酸雾及其它腐蚀性气体进入仪器室，当测量具有挥发性或腐蚀性样品溶液时，应加吸收池盖，实验结束时，应及时对样品室进行清理。

2. 分光光度计波长的测试及校正　波长的变化对分析结果的质量影响极大，对于购置的新仪器，必须对其波长进行检测，正在使用的仪器也要定期每年检查2－3次。

产生波长误差的原因主要是仪器在装备或运输过程中，波长装置中各种部件与出射狭缝间相对位置发生变化，或是工作室温度，湿度变化过大，记录系统的机械零件的磨损．积尘而不能正常转动，记录纸受潮变形等。常用的检查和校正的方法有：

(1) 用标准镨钕滤光片、钬玻璃滤光片等，主要用于可见光，方法是(以镨钕滤光片为例)测量529nm和808nm2个吸峰，如测出的吸收峰与名义值(刻度值)不同，即通过调节准直镜反射角度，从而使出的单色光波长发生改变；或者调整刻度来进行校正。

(2) 用氢灯、氘灯或低压汞灯发射的光谱线，其方法如下(以汞灯为例)：将仪器预热到正常工作温度，保持一定的室温，将汞灯置于靠近单色器的入射狭缝处，使孤光形成一直线聚焦于入射狭缝，狭缝宽度调至最小，以最慢速度进行扫描，全部测量应按仪器正常扫描方向进行，避免反转，对手动式仪器，应按一个方向仔细调节波长鼓轮，读出最大透光率的波长，依顺序逐一核对谱带的位置，最常用的谱线是579.0nm，576.9nm435.8nm，404.5nm，364.9nm，253.7nm，将观测到的最大透光率谱线位置与上述相应的谱线之间的差值(波长误差)作图，得出效正曲线，对全波段的波长误差一般不应超过±1nm。

(3) 采用Ho(CLO4)3，CuSO4 ，CoSO4，K2CrO4，K2Cr2O7等标准样品溶液。Ho(CLO4)3在紫外－可见光谱区有狭窄的锐带，吸收峰值可以精确到1nm，是常用的标准溶液。

(三) 保养和维护

1. 光源：光源灯有一定的寿命，仪器不工作时不要开灯，若工作间歇时间短，可不关灯和停机，一旦停机，则要待灯冷却后再重新启动，并预热15min。灯泡发黑或亮度明显减弱或不稳定，就及时更换；移动光源不要用手直接接触窗口(要戴手套)以免手上油污沾附在窗口上，经紫外光照后形成结痕(可用无水乙醇去除)，更换光源时要注意调好灯丝和进光窗的相对位置，使光能尽可能多的进入光路，否则灵敏度下降。

2. 单色器是分光光度计的核心部分，装置在一密封盒内，一般不宜拆开，要经常更换单色器盒的干燥剂，防止色散元件受潮生霉；仪器使用半年以上或搬动后，要进行波长读数的校正。

3. 吸收池是光度测量最常用的仪器，要注意保护吸收池的光学面，不允许将容易擦伤光学面的物体放入吸收池内，一般用柔软的棉织物或绸布擦干，不用时拭干置于吸收池盒内或浸泡在蒸馏水中。用后的吸收池应立即清洗。

测试样品时必须根据波长选用吸收池，用紫外光测定时须用石英杯，否则紫外光无法透过。